核心蛋白聚糖在肝纤维化形成中的作用

背景：肝纤维化可进展为肝硬化,并破坏肝脏正常结构,从而导致肝功能异常和不可逆肝硬化。本研究以四氯化碳小鼠肝纤维化模型为研究对象,观察外源性核心蛋白聚糖对纤维化形成是否有缓解作用。 方法：5周龄Balb/c小鼠,腹腔注射CCl4 5周建立肝纤维化模型,注射剂量为1ml/kg (CCl4体积:橄榄油体积=1:1),每2天注射1次。检测肝标本中肝纤维化相关分子表达情况。 腹腔注射CCl4三周后,将存活纤维化小鼠随机分为2组（每组6只）,实验组（DCN组）以及纤维化对照组。同时建立5周正常对照组（6只）。每天两次予实验组注入250ug/kg核心蛋白聚糖DCN,对照组注射等量的（PBS NS）溶液。DCN注射2周后,取下三组肝脏标本。取下方叶并将其分成两部分：一部分切成多个小块用于提取组织RNA,检测相关基因表达情况;另外一部分放入福尔马林中用于HE染色、Masson染色以及免疫组化检测相关指标。 结果：外源性小鼠DCN蛋白可缓解四氯化碳诱导的肝纤维化。实验组较对照组肝纤维化程度明显减轻,胶原纤维量明显低于对照组。 结论：本部分实验以小鼠肝纤维化模型为实验对象,自3周开始向实验组注射DCN蛋白,结果表明外源性DCN可以抑制纤维化相关分子的表达,缓解肝纤维化形成。     

肝细胞生长因子与肝纤维化关系研究进展

肝细胞生长因子是一种多效性的细胞因子,具有促细胞分裂、增殖、运动、抗纤维化等多种生物学活性。它可以通过抑制减少转化生长因子β1合成和信号转导、减少肝星形细胞活化和增殖、抑制胶原纤维合成、促进细胞外基质降解、抑制上皮-间质转化等多种机制来发挥抗肝纤维化效应,具有开发成为一种有效的抗纤维化临床药物的巨大潜能。     

硫化氢对大鼠肝星形细胞增殖和氧应激的影响

目的探讨H2S对大鼠肝星形细胞（HSC）增殖和氧应激的影响。方法用铁超载的方法复制HSC增殖模型,通过绘制生长曲线以及CCK-8细胞计数法检测不同浓度的H2S对500μmol／L次氮基三乙酸铁（FeNTA）作用下的HSC增殖的影响。通过不同浓度的H2S作用于500μmol／LFeNTA培养的HSC,检测6h、12h、24h细胞上清液和裂解液中H2S、SOD活力、MDA含量,观察H2S对HSC氧应激反应的影响。结果同对照组比较,一定浓度的H2S对HSC增殖有抑制作用。在FeNTA诱导的氧应激反应中,一定浓度范围的H2S可有效提高SOD的活性和降低MDA含量。结论H2S对HSC增殖有较强抑制作用,对FeNTA诱导的氧应激具有保护作用。     

肝纤维化早期肠源性内毒素血症对肝星形细胞活化的影响

目的探讨早期肝纤维化时肠源性内毒素血症（IETM）对肝星形细胞（HSC）的活化有无影响。方法采用复合因子方法复制肝纤维化模型，同时加甘氨酸治疗组。饲养3周后，透射电镜下观察肝星形细胞在不同组间的活化情况，测定各组的血浆内毒素水平，同时也测定了肿瘤坏死因子（TNF-α）的水平。结果透射电镜下3周末观察到了HSC的活化，且肝纤维化组和甘氨酸组间HSC的活化程度不同，有IETM发生，且肝纤维化组和甘氨酸组间的内毒素含量有差异。结论早期肝纤维化发生时肝星形细胞的活化可能与肠源性内毒素血症有关。     

硫化氢对氧应激大鼠肝星形细胞的影响

目的探讨硫化氢（H2S）对大鼠肝星形细胞（HSC）增殖和氧应激的影响。方法用铁超载的方法复制肝纤维化的氧应激模型,给予外源性H2S供体硫氢化钠（NaHS）和炔丙基甘氨酸（PPG,H：S合成关键酶胱硫醚-γ-裂解酶CSE抑制剂）,通过绘制生长曲线法和用CCK-8细胞计数法测定不同浓度H2S和PPG分别作用于500μmol／L次氮基三乙酸铁（FeNTA）培养下的HSC6、12、24h细胞上清液和裂解液中H2S浓度、超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量,通过检测HSC的增殖情况、CSEmRNA表达水平、H2s浓度和氧化抗氧化指标（MDA、SOD）来探讨H2S对HSC氧应激的影响。结果FeNTA所致的增殖HSC氧应激损伤明显增加,抗氧化能力减弱。同时,CSEmRNA表达水平低下,H2S产生减少。给予PPG后,HSC增殖显著且CSEmRNA表达受到抑制。内源性H2S随着严重的氧应激损伤进一步减少。给予NaHS后,HSC增殖减少,CSEmRNA表达和H2S产生显著增加以缓解氧应激损害和增强抗氧化能力。结论H2S对HSC增殖具有一定的抑制作用,对FeNTA诱导的氧应激具有保护作用。     

肝星形细胞凋亡机制的最新进展

慢性肝病是全球重要死因之一,各种致病因素所致慢性肝损伤均可引起肝纤维化。近年来临床和实验数据均显示肝纤维化甚至肝硬化均可通过肝星形细胞(HSC)的凋亡而得以逆转,因此,阐明肝星形细胞凋亡的分子机制成为发展抗纤维化药物的重要途径之一。肝星形细胞的凋亡受多种因素调控,包括生长因子及其受体、自然杀伤细胞、细胞外基质组分、神经内分泌通路、药物制剂以及翻译后修饰均可影响肝星形细胞的凋亡。在此就各相关因素进行综述。     

肝星形细胞的分离与培养

目的 :分离培养大鼠肝星形细胞 ,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础。方法 :采用IV型胶原酶、链酶蛋白酶消化肝脏 ,密度梯度离心分离HSC ,台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率 ,Desmin免疫细胞化学法鉴定HSC纯度。结果 :每只成年大鼠肝脏的HSC得率为 (2 33± 0 1 5)× 1 0 7个 ,细胞存活率在 95 %以上。免疫细胞化学显示 ,desmin阳性细胞为 (90 3± 2 8) % ,传代培养后阳性细胞在 98%以上。结论 :建立了稳定、高产的HSC分离方法 ,细胞得率、活率、纯度方面达到了国内外文献报道的水平     

肠源性内毒素血症与肝星形细胞在肝纤维化中的作用

目的 研究IETM与α-SMA在肝纤维化中的作用,以进一步了解二者的关系.方法 21只Wistar大鼠随机分为对照组(n=6)和肝纤维化组(n=15).正常对照组饲以正常饮食,肝纤维化组采用复合因子方法 饲养大鼠建立肝纤维化模型.饲养4周后,透射电镜下观察肝星形细胞的活化,免疫组化方法 观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,并测定血浆中的内毒素含量,同时也测定了丙氨酸转氨酶(ALT)、透明质酸(HA)、丙二醛(MDA)的水平.结果 4周末透射电镜下肝纤维化组观察到了HSC的活化,免疫组化法观察到了肝纤维化组α-SMA表达明显高于对照组,血浆中ET、ALT、HA、MDA的含量肝纤维化组明显高于对照组.结论 肝纤维化发生时有肠源性内毒素血症的发生和肝星形细胞的活化,二者之间可能存在一定关联.     

核心蛋白聚糖对兔肌腱细胞增殖及细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白聚糖(decorin,DCN)对兔肌腱细胞体外增殖和细胞周期的影响,以探讨decorin在肌腱愈合中对肌腱细胞的作用.方法 原代培养兔肌腱细胞,分别加入不同浓度(0.25、1.25、2.5、5μg/ml)的decorin;培养12、24、48 h用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度;镜下观察低浓度DCN作用24 h后对兔肌腱细胞增殖的影响;低浓度DCN培养24 h后用流式细胞仪检测细胞周期.结果 0.25、1.25、2.5μg/ml浓度decorin作用12 h后对兔肌腱细胞增殖有着减少的趋势,但是24 h后却明显地促进其增殖(P＜0.05),但是48 h后差异不显著.而5μg/ml浓度组作品12 h对兔肌腱细胞增殖有着增加的趋势,24 h后促进增殖作用显著(P＜0.05),48 h后却抑制兔肌腱细胞的增殖.0.25μg/ml低浓度decorin作用兔肌腱细胞24h后镜下观察和流式细胞分析,细胞增殖明显增强,S期增加,PI明显大于对照组(P＜0.05).结论 低、中浓度decorin对兔肌腱细胞的增殖起着先延迟后促进的作用,提示在肌腱愈合中如果在肌腱和腱鞘之间运用DCN,可能起到早期隔离TGF-β对腱鞘成纤维细胞的作用,而后期增强TGF-β对腱内膜细胞的作用,从而促进内源性愈合,减少外源性愈合,达到减少粘连的效果.     

Effects of ribozyme targeting platelet-derived growth factor receptor β subunit gene on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells in vitro

Background Activation and proliferation of hepatic stellate cells (HSC) is essentially involved in the development and progression of hepatic fibrosis. The most potent growth factor for HSC is platelet-derived growth factor receptor (PDGF) and PDGF receptor β subunit (PDGFR-β) is the predominant signal transduction pathyway of PDGF which is overexpressed in activated HSC. This study investigated the cleavage activity of hammerhead ribozyme targeting PDGFR-β mRNA in HSC and the effect on biological characteristics of HSC.Methods Expression vector of anti-PDGFR-β ribozyme was constructed and transfected into rat activated HSC with lipofectamin. The positive cell clones were gained by G418 selection. The expression of PDGFR-β, α-smooth muscle actin, and typeⅠand type Ⅲ collagen were detected by using Northern blot, Western blot and immunocytochemical staining, respectively. The cell proliferation was determined with MTT colorimetric assay. The cell apoptosis was analyzed by using flow cytometry, acridine orange fluorescence vital staining and transmission electron microscopy.Results The expression of PDGFR-β at mRNA and protein level was markedly reduced in ribozyme-transfected HSC by 49%-57% (P<0.05-0.01). The proliferation and α-smooth muscle actin expression of ribozyme-transfected HSC were significantly decreased (P<0.05-0.01), and the type Ⅰ and type Ⅲ collagen synthesis were also reduced (P<0.01). In addition, the proliferative response of ribozyme-transfected HSC to PDGF BB was significantly inhibited. Otherwise, the apoptotic cells were significantly increased in ribozyme-transfected HSC (P<0.01), and typical apoptotic cells could be found under transmission electron microscopy.Conclusions The anti-PDGFR-β ribozyme effectively cleaved the target RNA and significantly inhibited its expression, which blocked the signal transduction of PDGF at receptor level, inhibited HSC proliferation and collagen synthesis, and induced HSC apoptosis. These results suggest that inhibiting PDGFR-β expression of HSC may be a new target for the therapy of liver fibrogenesis, and ribozyme may be a useful tool for inhibiting PDGFR-β expression.     

转染金属硫蛋白基因1A促进大鼠肝星状细胞增殖

目的: 观察金属硫蛋白基因1A(MT1A)对肝星状细胞(HSCs)增殖的影响.方法: 构建MT1A基因真核表达质粒,转染HSCs.通过RT-PCR、Western blotting法检测导入的质粒在HSCs中的表达,采用AgNOR染色法及Ki-67抗原免疫细胞化学染色检测 HSCs增殖指数.结果: MT1A基因在HSCs中过表达;转染MT1A基因组每个细胞AgNOR颗粒数(5.43±0.45)较pcDNA3.1组(3.94±0.39)及非转染组(4.14±0.34)均高(P<0.05);免疫细胞化学染色结果显示,转染MT1A基因组细胞Ki-67染色呈阳性,而对照组为阴性.结论: 外源MT1A基因在HSCs中过表达可促进其增殖.     

MicroRNA-29b 对肝纤维化及肝星状细胞 增殖、凋亡的影响

目的 探究microRNA-29b（miR-29b）在肝纤维化过程中的作用,以及对肝星状细胞增殖和 凋亡的影响。方法 将大鼠随机分为对照组和模型组,每组10 只。模型组大鼠经腹部注射60% 3 ml/kg CCl4 复制肝纤维化模型;对照组注射等量生理盐水。分别观察两组大鼠肝纤维化情况,检测肝组织中miR -29b 、 TGF -β 1、SAMD 3 基因及TGF-β1、SAMD3 蛋白的表达。体外培养肝星状细胞HSC-T6、LX-2,转染 miR-29b siRNA,检测miR-29b 对HSC-T6、LX-2 细胞增殖、凋亡的影响,以及对TGF-β1、SAMD3 表 达的影响。结果 与对照组相比,模型组心肌纤维比例增加,随着时间延长,第6 和12 周心肌纤维比例逐渐 升高（P <0.05）。与对照组相比,模型组miR -29b 基因相对表达量降低,随着时间延长,模型组miR -29b 基 因相对表达量逐渐降低（P <0.05）。与对照组相比,模型组TGF-β1、SAMD3 基因和蛋白相对表达量升高; 随着时间延长,TGF-β1、SAMD3 基因和蛋白相对表达量逐渐升高（P <0.05）。在HSC-T6、LX-2 细胞中, miR-29b 转染组G1 期细胞比例高于空白对照组、阴性转染组,S 期细胞比例低于空白对照组、阴性转染组 （P <0.05）。miR-29b 转染组HSC-T6、LX-2 细胞凋亡率高于空白对照组、阴性转染组（P <0.05）。与空白 对照组、阴性转染组相比,HSC-T6、LX-2 细胞中TGF-β1、SAMD3 基因和蛋白相对表达量升高,miR- 29b 基因相对表达量降低（P <0.05）。结论 miR-29b 在肝纤维化过程中表达降低,miR-29b 可抑制肝星状 细胞增殖,诱导其凋亡。     

苦参素对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨苦参素对肝纤维化发生的作用机制。方法培养激活的HSC-T6分为对照组及实验组,实验组以不同浓度的苦参素干预(分别为30、60、120、240、480、960 mg/L),MTT法检测肝星状细胞的增殖,TUNUL法检测凋亡指数。结果药物干预后肝星状细胞的增殖能力降低,凋亡指数升高,均呈剂量依赖性。结论苦参素能通过抑制肝星状细胞的增殖和促进其凋亡来影响肝纤维化的发展。     

木黄酮对培养肝星状细胞增殖及脂质过氧化的影响

目的 以培养的大鼠肝星状细胞(HSC)为模型,测定植物雌激素木黄酮对HSC增殖及培养液中脂质过氧化产物的影响.以明确木黄酮抑制肝纤维化形成的作用.方法 采用培养的SD大鼠肝星状细胞(HSC-T6)为模型,培养后加入H2O3诱导氧化应激,分为3组,用不同浓度的木黄酮温育48 h,收集细胞培养基的上清液,每个浓度设6个重复组,用MTT法检测HSC增殖;收集细胞培养基上清液,采用试剂盒方法测定脂质过氧化产物超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱苷肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX).结果 木黄酮各剂量组不同程度降低HSC的增殖.呈剂量-效应关系.给予木黄酮后,MDA和GSH水平明显降低,SOD和GSH-PX活力明显升高.也呈剂量-效应关系.结论 植物雌激素木黄酮具有抑制肝纤维化形成的作用,其作用机制可能与抑制HSC的增殖及抗HSC氧化应激、抗脂质过氧化作用有关.     

AcSDKP对大鼠活化HSCs增殖及分泌细胞外基质的影响

目的通过N-乙酰基-丝氨酸-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)干预,观察其对活化肝星状细胞(HSCs)的增殖以及合成和分泌细胞外基质(ECM)的影响。方法大鼠原代HSCs分离、培养和鉴定后,分别给予0.01、0.1、1、10、100nmol/LAcSDKP进行干预,设立空白对照组。MTT法检测AcSDKP干预对HSCs增殖的影响;RT-PCR技术检测活化HSCsⅠ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)mRNA表达;酶联免疫法检测培养细胞上清液透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)含量。结果与空白对照组相比,1、10nmol/LAcSDKP干预显著抑制活化HSCs的增殖;1、10nmol/L及0.1～100nmol/LAcSDKP的干预,分别显著抑制HSCsColⅠmRNA和ColⅢmRNA表达;0.1、1、10nmol/L和0.1、1nmol/LAcSDKP干预可分别显著抑制培养上清液HA和LN的表达。结论本实验发现,AcSDKP可抑制活化HSCs合成和分泌ECM,并呈现一定的剂量依赖性,以浓度为1nmol/L时作用最为显著。其作用机制可能与抑制HSCs增殖而使合成和分泌ECM的HSCs数量减少有关。     

肝星形细胞中细胞凋亡和存活的信号调控

肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)在肝脏纤维化发生过程中起着关键作用.当正常肝脏受到损伤时,HSCs由静息状态转分化为类肌成纤维细胞,并保持这种处于激活状态的表型,它们接收到的凋亡和存活的生物信号将决定激活态HSCs的最终细胞寿命.HSCs凋亡的发生与一系列复杂而又相互关联的生物信号传导和调控有关,HSCs凋亡信号来自于细胞膜受体,如死亡受体、神经生长因子受体和外周型苯甲二氮卓受体(peripheral-type benzodiazepine receptor);以及胞浆蛋白,如Bcl-2家族蛋白和细胞周期蛋白等.HSCs存活信号受到多种激酶和细胞因子的诱导,如金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue jnhibitors of metalloproteinase-1)、Rho/Rho激酶、血小板源生长因子(platelet-derived growth factor)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1)和胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1)等.特异性地诱导HSCs发生凋亡是治疗肝脏纤维化的直接和有效手段,虽然目前对HSCs由激活态到静息状态的转归尚需进一步研究,但诱导HSCs凋亡将是治疗肝脏纤维化和肝硬化的研究热点和主要发展方向.     

血管紧张素II和洛沙坦对肝星状细胞生长、增殖的影响

目的探讨血管紧张素II(AngII)及其1型受体(AT1a)拮抗剂洛沙坦(losartan),对肝星状细胞(HSCs)生长、增殖的影响。方法①分离大鼠HSCs,培养及鉴定;②在不同浓度的AngII或losartan作用下,观察HSCs生长情况分别绘制细胞生长曲线、采用MTT法、3H-胸腺嘧啶核苷掺入释放法检测AngII或losartan对HSCs生长、增殖的影响。结果AngII刺激组在浓度高于10-9 mol/L时,与对照组相比HSCs数量明显增多,DNA含量显著增加(P<0.05 );losartan在浓度高于10-8 mol / L时,HSCs数量明显减少,DNA含量显著降低(P<0.05 );(losartan AngII)组HSCs数量与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论AngII可以促使HSCs迅速增殖,其拮抗剂losartan明显抑制HSCs的生长、增殖。     

肝星状细胞的免疫学特性

 活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）可合成大量细胞外基质（extracellular matrix,ECM）,并可分泌转化生长因子β（transforming growth factor-β,TGF-β）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor,PDGF）等促纤维化因子,在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。近来研究发现活化的肝星状细胞具有多种免疫细胞的特性,可直接参与肝脏局部免疫调控,而免疫因素在肝纤维化发病机制中占据着重要地位,因此深刻认识肝星状细胞的免疫学特征有助于进一步阐明肝纤维化的发病机制。