肠道病毒71型中和抗体的保护水平

目的通过检测乳鼠模型、健康婴幼儿和疫苗免疫后目标人群的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)中和抗体效价,为确定EV71疫苗保护水平提供基础数据。方法 6份不同EV71病毒株免疫血清经中和抗体准确定量后,分别通过两个EV71乳鼠攻毒模型,检测EV71中和抗体保护水平。采用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,分别对健康婴幼儿及疫苗免疫后血清进行中和抗体准确定量。结果在2个乳鼠攻毒模型中,6份免疫血清的中和抗体保护水平接近,ED50分别为10～50 U和6.1～54.2 U;婴幼儿人群7、12和24月龄抗体阳性率分别为45.0%、48.8%和56.8%,阳性人群的抗体效价分别为113.8、120.3和330.6U/m(l均值为173.2 U/m)l,母亲抗体阳性率和效价分别为86.7%和114.3 U/ml;中、高剂量疫苗2针免疫后,婴幼儿抗体阳性率均为100%,效价为356.0和1 136.2 U/ml,较婴幼儿人群自然感染水平高2.1～6.6倍。结论应用标准化的中和抗体检测法和EV71中和抗体定值标准品,确定了以U/ml为单位的乳鼠攻毒抗体保护水平及婴幼儿人群抗体水平和疫苗免疫后抗体水平,为EV71疫苗免疫人群中和抗体保护水平的确定提供了依据。     

肠道病毒71型基因重组的研究进展

肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)的主要病原体,属于肠道小RNA病毒,这类病毒的基因组由脆性平链RNA组成,易断裂,有较高的突变性。在混合感染中会发生同型不同株不同亚型,或同属不同型间的基因交换形成新的重组病毒,EV71也具有重组特性。新形成的重组病毒可能导致其生物学特性和致病性的改变,进而影响疾病的防控。本文就EV71病毒基因重组及可能引发的防控问题进行综述。     

人肠道病毒71型中和抗体检测方法的实验室评价

目的对人肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)中和抗体检测方法进行实验室评价,为该方法的标准化提供依据。方法 5个实验室按照统一制定的EV71中和抗体检测操作细则(SOP),应用A、B和C基因型的10株EV71病毒株,分别测定10份人免疫球蛋白、20份健康成人血浆和15份EV71动物高效价免疫血清样品中EV71中和效价,检测实验室内、实验室间重复性及不同EV71病毒株对中和抗体检测的影响。结果相同实验室应用各病毒株重复测定中和效价的最大值与最小值(Max-Min)倍数差均在4倍以内,3次重复试验结果间差异无统计学意义(P值均>0.05);不同实验室应用相同病毒株检测结果的Max-Min倍数差在4倍以内;不同实验室应用不同病毒株检测结果为:A型株与其他基因型病毒株中和效价的Max-Min差在192倍以内,B3与C4亚型的病毒株中和效价的Max-Min倍数差在64倍以内,C4亚型不同病毒株之间中和效价的Max-Min倍数差在16倍以内。结论按统一SOP操作后,EV71中和抗体检测方法应用相同毒株在实验室内和实验室间具有较好的重复性,而不同病毒株对中和效价的测定结果有较大影响。     

静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH 4)的研制

目的研制静注肠道病毒71型人免疫球蛋白(pH 4)[Enterovirus 71 human immunoglobulin(pH 4)forintravenous injection,EV71-IVIG],用于治疗重症手足口病。方法采用细胞病变抑制法检测原料血浆的抗EV71中和抗体效价(EV71 neutralizing antibody titer,EV71-NT),确定EV71抗体血浆的筛选标准;从健康人血浆中筛选中和效价较高的EV71血浆,按《中国药典》三部(2010版)的生产工艺连续制备3批EV71-IVIG;以乳鼠模型评价EV71-IVIG的治疗效果,并以细胞病变抑制法检测EV71-IVIG对EV71临床分离株及CA16病毒的中和活性。结果从90批原料血浆中筛选出约3.8吨EV71抗体血浆,制备的3批EV71-IVIG符合《中国药典》三部(2010版)"静注人免疫球蛋白(pH 4)"的质量标准,EV71-NT为国内普通IVIG的4～5倍。0.5 mg EV71-IVIG即可充分保护经10 LD50EV71攻击的乳鼠,存活率达100%。EV71-IVIG对最近几年流行的EV71临床分离株有较高的中和活性。结论已成功研制EV71-IVIG,为重症手足口病患者的治疗提供了新的用药选择。     

肠道病毒71型疫苗交叉保护能力的研究进展

肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是引起手足口病的主要病原体,研发疫苗是防控该病疫情的有效措施。目前全球已有5家企业或机构研发的单一基因型EV71全病毒灭活疫苗进入临床试验阶段。然而由于不同地区EV71流行株基因型不同,了解单一EV71疫苗株制备的疫苗对其他流行株的交叉保护能力,对疫苗的应用具有重要意义。本文对近年来EV71疫苗交叉保护能力的研究进展作一综述。     

EV71全病毒灭活疫苗的研究进展

近年来手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)在我国持续流行,已经成为危害儿童健康的严重疾病。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)感染是引起HFMD病例和婴儿重症死亡的主要病因。为控制EV71感染的流行,国内外均在开展不同种类EV71疫苗的研发,其中以灭活疫苗的进展最快,目前国内3家EV71全病毒灭活疫苗即将进入Ⅲ期临床试验阶段。本文就全病毒灭活疫苗的研发进展及质量控制和评价要点作一综述。     

氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响

目的评价氢氧化铝佐剂对肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)灭活疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的影响。方法用含铝佐剂及无佐剂EV71灭活疫苗免疫BALB/c小鼠,并设生理盐水对照组。于加强免疫后7 d采血,进行小鼠脾单个核细胞(Mononuclear cell,MNC)的分离及CD8+T细胞的去除,采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测经EV71疫苗原液或VP2-36刺激后的小鼠脾MNC分泌IFNγ水平;应用液相芯片技术(LUMINEX)检测经EV71疫苗原液刺激后的小鼠脾MNC分泌IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10水平;采用体外微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体效价。结果 BALB/c小鼠经2次免疫后,铝佐剂疫苗组小鼠脾MNC的IFNγSFC值显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂疫苗组分泌IL-6和IL-10水平显著高于无佐剂疫苗组(P均<0.05);铝佐剂与无佐剂疫苗组小鼠血清EV71中和抗体阳转率均达到100%,铝佐剂疫苗组诱导的中和抗体效价显著高于无佐剂疫苗组(P<0.01)。结论 EV71灭活疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性IFNγ、IL-2、IL-6和IL-10应答,铝佐剂可同时增强EV71灭活疫苗的Th1和Th2类免疫应答。     

北京市朝阳区部分婴幼儿肠道病毒71型感染率及手足口病发病情况分析

目的分析北京市朝阳区部分婴幼儿肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染率及手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)发病情况。方法选择北京市朝阳区小红门、酒仙桥社区6~35月龄健康婴幼儿为观察对象,共采集血清414份,检测中和抗体水平,并采集符合可疑肠道病毒病入选标准患者的咽拭子和肛拭子标本,应用RT-PCR法进行其他肠道病毒EV-G、柯萨奇病毒A16型(Coxsackie virus type A16,CA16)、EV71特异性核酸筛查。同时对观察对象进行1年随访,调查HFMD发病情况。将观察对象分为6~11月、12~17月、18~23月、24~29月、30~35月5个月龄组。结果 414名观察对象中,EV71中和抗体阳性39人,阳性率为9.42%,随着月龄的增加,阳性率呈递增趋势(P0.001);男性婴幼儿EV71中和抗体阳性率为8.90%(17/191),女性为9.87%(22/223),二者差异无统计学意义(P0.05)。414名观察对象中,29例肠道病毒阳性,其中女性14例,男性15例,男女发病比例为1.07:1;CA16感染率为31.03%(9/29),EV71感染率为17.24%(5/29),其他肠道病毒感染率为51.72%(15/29)。尚不能认为男女性别间肠道病毒感染及EV71和CA16感染的构成比有差别,也不能认为EV71中和抗体情况对肠道病毒感染率和EV71发病率有影响;随着年龄的增长,EV71感染人数呈递增趋势,而CA16则保持不变;小红门社区EV71中和抗体阳性率(12.25%)与酒仙桥社区(4.45%)差异有统计学意义(P0.05)。结论月龄越大,婴幼儿血清EV71抗体阳性率越高;小红门和酒仙桥地区检测到的HFMD患儿主要病原体为CA16和EV71,且CA16感染率高于EV71感染率。     

四川地区供浆员中肠道病毒71型中和抗体效价的分布

目的通过检测EV71中和抗体效价(EV71-NT),对四川地区供浆员中EV71-NT的分布进行分析。方法应用基于细胞病变抑制的EV71-NT检测方法,检测四川地区349份健康人血浆的EV71-NT,同时用肠道病毒(EV)71型抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)检测其EV71抗体,并分析二者的相关性;检测四川地区21 817份健康人血浆中EV71-NT的分布。结果该EV71-NT检测方法具有较好的重复性,测定高效价和低效价EV71中和抗体标准品的变异系数分别为30.9%和33.6%;该方法与ELISA法的相关性较差(r=0.024);四川地区21 817份健康人血浆中含高效价EV71中和抗体的比例在7.1%～18.4%之间,EV71高效价血浆占10.3%。结论在四川地区供浆员血浆中含有一定比例的高效价EV71中和抗体,可以直接从自然感染人群中筛选EV71抗体血浆进行EV71特异性免疫球蛋白的研制。     

肠道病毒71型灭活疫苗质量一致性评价

<正>近年来,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)引起的手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)已成为我国严重的公共卫生问题~([1-2])。为防控EV71引起的严重HFMD流行,在国家科技支撑项目和重大新药项目的支持下,历经8年攻关,由中国医学科学院医学生物学研究所(简称昆明所)和北京科兴生物制品有限公司(简称科兴公司)研发的创新型     

肠道病毒71型吉林分离株的全基因组序列分析

目的对2011年吉林省肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)分离株全基因组进行序列分析。方法将手足口病伴发重症脑炎患者的粪便样品接种至Vero细胞,分离EV71;采用RT-PCR法分8段扩增全基因组序列,进行双酶切及序列测定;应用Mega5软件构建EV71系统进化树;通过DNAMAN7和DNASTAR7软件进行EV71分离株核苷酸和氨基酸序列的同源性比较;经RDP4软件对EV71分离株进行同源重组分析。结果粪便样品接种至Vero细胞2 d后,细胞出现圆缩、透亮、聚堆的病变现象;各PCR扩增产物经双酶切鉴定,均可见与预期大小一致的目的条带;经种系进化树分析显示,EV71分离株属C4a亚型,命名为EV71-JiLin-11-China;其与A、B和C亚型间核苷酸序列的平均同源性分别为22.44%、17.72%和11.96%,与A、B和C亚型间氨基酸序列的平均同源性分别为96.0%、97.2%和97.3%;全基因同源重组分析显示,EV71分离株的165～1 946和7 289～7 366核苷酸区有重组现象,分别源于分离自湖北的C4a-EV71-Hubei-09-China及马来西亚的B4-SB2864-SAR-00和C1-S18062-SAR-98。结论 2011年吉林地区流行的EV71为C4a基因型,为EV71基因特征及流行病学的研究提供了实验依据。     

Functional Insights into Silymarin as an Antiviral Agent against Enterovirus A71 (EV-A71)

Enterovirus A71 (EV-A71) is a major neurovirulent agent capable of causing severe hand, foot and mouth disease (HFMD) associated with neurological complications and death. Currently, no FDA-approved antiviral is available for the treatment of EV-A71 infections. The flavonoid silymarin was shown to exert virucidal effects, but the binding site on the capsid was unknown. In this study, the ligand interacting site of silymarin was determined in silico and validated in vitro. Moreover, the potential of EV-A71 to develop resistance against silymarin was further evaluated. Molecular docking of silymarin with the capsid of EV-A71 indicated that silymarin binds to viral protein 1 (VP1) of EV-A71, specifically at the GH loop of VP1. The in vitro binding of silymarin with VP1 of EV-A71 was validated using recombinant VP1 through ELISA competitive binding assay. Continuous passaging of EV-A71 in the presence of silymarin resulted in the emergence of a mutant carrying a substitution of isoleucine by threonine (I97T) at position 97 of the BC loop of EV-A71. The mutation was speculated to overcome the inhibitory effects of silymarin. This study provides functional insights into the underlying mechanism of EV-A71 inhibition by silymarin, but warrants further in vivo evaluation before being developed as a potential therapeutic agent.     

EV71抗原BA-ELISA检测方法的建立及应用

目的建立EV71抗原生物素-亲和素酶联免疫(BA-ELISA)检测方法,并进行验证及初步应用。方法以抗EV71抗体为包被抗体,利用生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA法,并对其灵敏度、特异性、准确性及精密性进行验证。采用该方法检测组织培养及临床样品中EV71抗原的含量。结果所建立的BA-ELISA法在EV71蛋白含量625～156.25ng/ml之间线性关系最佳,R2达0.9976,灵敏度为78.125～156.25ng;与包括CoxA16在内的42种肠道病毒及相关病毒均无交叉反应;检测10份EV71阳性样品和10份阴性样品,结果符合率均为100%;检测EV71原液和高、中浓度样品的变异系数分别为3.09%、6.69%和6.43%;可检出约103～104CCID50的活病毒及手足口病患者的大便悬液和部分咽拭子悬液中的病毒。结论用生物素标记EV71抗体与亲和素系统建立的双抗体夹心ELISA法具有较高的特异性、灵敏度、准确性和精密性,为临床检验及抗原分析提供了参考。     

CA16疫苗及其相关研究进展

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)为严重影响婴幼儿健康的传染病。肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)与柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)是引起HFMD的主要病原体之一,曾引起包括中国等多个国家或地区HFMD的流行或暴发。疫苗是控制传染病流行的主要手段。EV71疫苗上市后,CA16疫苗和EV71/CA16联合疫苗及其相关研究已成为人们关注的热点。本文对CA16疫苗研发及其相关研究的最新进展作一综述。