白细胞介素12融合基因联合白细胞介素2对肝癌的基因治疗

我们在肝癌基因治疗目的基因筛选的实验中发现,在大鼠肝癌模型中,IL-12的基因治疗作用最为显著[1,2],若同时联合IL-2,有望进一步提高对肝癌的治疗效果. 1.材料与方法:大鼠肝癌细胞株CBRH3由中科院细胞所谢弘教授惠赠.以质粒GCp35Ep40PN为模板,PCR分别扩增p35和p40亚基基因.以PCR产物为模板,用p40上游引物和p35下游引物再次进行PCR反应,构建mIL-12融合基因.mIL-12和hIL-2基因分别插入逆转录病毒载体GCXEXPN,命名为GCIL12EXPN和GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN.按常规方法筛选逆转录病毒载体GCIL12EXPN、GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN的PA317包装细胞株,测病毒滴度.用CBRH3建立大鼠接种肝癌模型,分为生理盐水、LacZ载体对照组和IL-2、IL-12、IL-12+IL-2治疗组,每组10只大鼠,将包装细胞株脾内注射进行治疗.方差分析结果.     

白细胞介素-15对小鼠胃癌的治疗作用

目的 建立小鼠胃癌模型,检测荷瘤状态对小鼠免疫细胞的影响,同时给予白细胞介素-15(IL-15)免疫基因治疗,以检测IL-15对胃癌的预防及治疗效果.方法 采用多因素联合攻击法诱导小鼠胃癌,同时采用IL-15表达质粒载体进行免疫基因治疗.20周后取胃标本行病理学检查,并取血及脾细胞检测T细胞亚群及CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg).同时进行自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性试验,通过统计学方法分析结果.结果 多因素联合攻击法诱导胃癌发生率为37.5％.诱癌组小鼠血清IL-15水平(9.20±2.92) ng/L明显降低(P＜0.05),且其脾NK细胞杀伤活性(216.91±117.80) U/L明显降低(P＜0.05).诱癌组小鼠外周血Treg水平(8.07±6.62)％明显升高(P＜0.05),而对照组小鼠脾细胞Treg水平(4.40±3.34)％明显降低(P＜0.05).各组小鼠之间外周血T细胞亚群变化差异无统计学意义(P＞0.05).诱癌组小鼠脾细胞CD3+T细胞水平(78.31±29.79)％明显升高(P＜0.05),而CD4+T细胞(19.98±5.77)％及CD8+T细胞水平(10.15±1.72)％明显降低(P＜0.05).结论 多因素联合攻击法为小鼠胃癌模型建立提供了良好的模型.小鼠荷瘤状态下免疫功能下降,通过IL-15免疫基因治疗可提高机免疫功能,起到抗肿瘤的效果.     

体外转染小鼠白细胞介素12基因抑制膀胱癌EJ细胞的实验研究

目的将含有小鼠白细胞介素12（mIL-12）全长基因的质粒转染到膀胱癌EJ细胞中,观察脾细胞对转染mIL-12膀胱癌细胞的杀伤作用。方法用脂质体转染法将含有mIL-12全长基因质粒转染到EJ细胞中,ELISA法检测IL-12表达水平。在脾细胞作用0～2 d时ELISA法连续检测上清干扰素γ（INF-γ）水平变化。转染后40 h加入制备好的小鼠脾细胞悬液约1×10^6作用24 h后,MTT法检测对膀胱癌细胞的抑制率。结果转染后40、60 h检测到IL-12的高表达（375±15） pg／ml和（400±50）pg／ml,较未转染组9～15 pg／ml明显增高;在EJ细胞表面可以检测到IL-12的表达,而对照组则无;加入脾细胞悬液1 d后,脾细胞加转染后的EJ细胞组的抑制率为58．7％（P〈 0．025）,而脾细胞加未转染EJ细胞组、单纯EJ细胞组以及转染的EJ细胞组差异无统计学意义（P〉 0．05）。脾细胞加入转染后EJ细胞上清24 h的。INF-γ为（155±21）pg／ml,与未转染组（65±8）pg／ml比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论体外转染mIL-12基因到膀胱癌EJ细胞中能够表达IL-12,在小鼠脾细胞存在的条件下,通过一系列的免疫调节作用,诱导T细胞、NK细胞等产生INF-γ等细胞因子从而杀伤膀胱癌细胞。     

携带小鼠白介素12基因的增殖型腺病毒对胃癌细胞株化疗敏感性影响的研究

目的研究携带白介素12(mIL-12)基因的增殖型腺病毒CNHK200-mIL-12对胃癌细胞株化疗敏感性的影响。方法扩增增殖型腺病毒Onyx-015及携带小鼠mIL-12基因的增殖型腺病毒CNHK200-mIL-12,利用MTT法测定同一病毒滴度下联合应用不同浓度化疗药物及同一化疗药物浓度下联合应用不同滴度病毒对胃癌细胞株杀伤作用,并观察增殖型腺病毒联合化疗药物对裸鼠腹腔种植瘤的抑制作用。结果当不同感染复数(MOI)=0.5时,增殖型病毒Onyx-015、CNHK200-mIL-12对胃癌细胞SGC-7901无明显的杀伤作用。加入化疗药物阿霉素(ADM)、氟尿嘧啶(5-Fu)和卡铂(CAP)后,两者对SGC-7901的杀伤率随着药物浓度增加都有不同程度的升高,与单纯使用化疗药物组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。浓度为10μg/ml的5-Fu对SGC-7901的杀伤作用不明显,单用增殖型腺病毒对SGC-7901的杀伤作用也较弱,两者联合应用杀伤活性明显提高,与未加5-Fu组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。动物试验证明:经Onyx-015联合5-Fu治疗后,裸鼠腹腔内肿瘤形成率为1/6,而CNHK200-mIL-12联合5-Fu组未见腹腔内肿瘤生长,与单用增殖型腺病毒或单用化疗者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论携带mIL-12基因的增殖型腺病毒能够提高胃癌细胞株对化疗药物的敏感性,在杀伤胃癌细胞株的作用中     

腺病毒介导p16基因转染对胃癌细胞作用的研究

目的　观察以腺病毒为载体介导 p16基因转染对胃癌细胞 (MGC80 3)生长的影响。方法　重组腺病毒Ad p16感染胃癌细胞 ,观察胃癌细胞生长情况 ;用Ad p16感染胃癌细胞接种于大鼠体内 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠接种的阳性率 ;用重组腺病毒Ad p16作用于胃癌大鼠模型 ,Ad lacZ为对照组 ,每组大鼠 10只 ,观察大鼠肿瘤的生长情况。结果　p16可以抑制胃癌细胞生长 ,促进胃癌细胞的凋亡 ,经Ad p16感染的胃癌细胞肿瘤发生率明显下降 (由 90 %降至 2 0 % )。腺病毒介导 p16基因作用胃癌大鼠模型 2周后肿瘤的重量 ( 2 .2 1± 0 .2 6 )g明显低于对照组 ( 5 .6 4± 0 .5 3)g ,差异有显著性 (P <0 .0 0 1)。应用免疫组织化学检查可见肿块有明显的淋巴细胞侵润。结论　腺病毒介导 p16基因对胃癌细胞有明显的抑制作用。     

构建携带EGFP标志人白细胞介素10基因的重组腺病毒载体

目的 构建携带EGFP标志人白细胞介素10(hIL-10)基因腺病毒载体.方法 以pSNAV2.0-hIL-10重组质粒为模板.PCR扩增hIL-10基因,获得hIL-10 cDNA片段,并酶切连接到带有含强绿色荧光蛋白基因(EGFP)标记的pDC316-IRES-EGFP-lacZalpha载体质粒上,Pmel线性化重组质粒pDC316-hIL-10-IRES-EGFP,与腺病毒包装系统AdMax转染293包装细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒,经反复感染293细胞扩增病毒后,进行离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数、滴度.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hIL-10-IRES-EGFP和重组腺病毒质粒Ad-hIL-10-IRES-EGFP.扩增纯化后.测得重组腺病毒颗粒数为3.2×1011VP/ml,OD260/OD280值约为2.0,滴度为1.1×1010TCID50/ml.结论 成功构建了重组腺病毒质粒Ad-hIL-10-IRES-EGFP,为进一步研究hIL-10基因奠定实验基础.     

白细胞介素12对肝癌基因治疗的实验研究

目的 研究携带白细胞介素１２（ＩＬ－１２）基因逆转录病毒载体对体内肝癌生长抑制作用,探索基因治疗肝癌新途径。方法 构建携带ＩＬ－１２的逆转录病毒载体,转染逆转录病毒包装细胞系ＰＡ３１７,应用该包装细胞对实验性肝癌大鼠进行治疗,观察抗肿瘤作用,免疫功能变化。     

白细胞介素12基因治疗结肠癌的实验研究

目的观察携白细胞介素12(mIL-12)基因逆转录病毒载体的包装细胞(PA317-mIL-12)瘤内注射后,对肿瘤生长的抑制及对荷瘤动物生存的影响。方法在非免疫缺陷的结肠癌动物模型上分别施以化疗、放射免疫(放免)导向治疗、PA317-mIL-12基因治疗以及放免导向与IL-12基因联合治疗,比较各治疗组的肿瘤抑制效果和荷瘤动物的生存情况。结果经筛选后的携有mIL-12逆转录病毒载体包装细胞系PA317-mIL-12的上清,mIL-12浓度48h达27ng/106细胞。治疗3周后,IL-12基因治疗组(GT组)和IL-12基因与RIT联合治疗组(GT加RIT组)无论瘤体积还是瘤重量均明显低于对照组,生存率明显高于对照组(P<0.01)。结论PA317-mIL-12瘤内注射可有效抑制肿瘤生长,延长荷瘤动物的生存时间。基因治疗疗效优于化疗、放免导向治疗。放免导向与IL-12基因联合治疗疗效更佳。     

胃腺癌上皮细胞、癌旁上皮细胞及其浸润淋巴细胞白细胞介素-12和白细胞介素-13的表达

白细胞介素 (IL) 12是一种多功能免疫促进因子[1] ,主要由Th1细胞产生 ,先前对其抗肿瘤的基础和临床 ,尤其是应用于肿瘤的免疫疗法有大量研究 ;近年来 ,发现肿瘤细胞也可表达IL 12。IL 13由Th2细胞产生 ,是多功能免疫抑制因子[2 ] ,为探讨IL 12、IL 13与胃癌的发生发展关系 ,我们应用即用型SABC免疫组织化学法 (SP法 )观察胃癌上皮细胞及其浸润淋巴细胞 (TIL)白细胞介素 12和白细胞介素 13的表达 ,并探讨其意义。一、材料和方法1.材料 :10例胃腺癌组织及其对照癌旁组织 ,均用石蜡标本 ,所有标本术前未经化疗、放疗和免疫治疗。…     

携带大鼠白细胞介素-10基因重组腺病毒载体的构建及其在肝星状细胞中的表达

目的　构建载有白细胞介素 10 (IL 10 )基因的 ,能在肝星状细胞 (HSC)稳定表达的重组腺病毒载体 ,为将来的肝纤维化基因治疗提供基础。方法　将IL 10cDNA克隆于腺病毒穿梭质粒PAdTrack CMV ,得到重组质粒PadTrack CMV IL 10。采用电穿孔法将质粒PadTrack CMV IL 10与腺病毒骨架质粒PadEasy 1共转化E .coliBJ5 183细胞 ,通过在细胞内同源重组 ,生成带有IL 10基因的重组腺病毒载体。重组腺病毒质粒经过 2 93细胞的扩增及CsCl的纯化 ,感染HSC细胞。结果　经形态学、病毒DNA酶切、聚合酶链反应 (PCR)和逆转录 (RT ) PCR等方法的鉴定 ,证实了载体构建的正确性 ,经测定 ,病毒滴度为 2 .5× 10 10 efu/ml。结论　成功构建带有IL 10cDNA的重组腺病毒载体 ,所携带的IL 10载体能够转染大鼠HSC并在HSC中稳定表达 ,为进一步的研究打下了基础。     

携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体内实验研究

目的 研究携带人Fas基因的两种重组腺病毒对瘢痕疙瘩的体内治疗效果。方法 构建瘢痕疙瘩裸鼠模型,应用携带Fas基因的常规腺病毒Ad—Fas（T）和细菌内重组腺病毒Ad—Fas（B）注射及Fas单克隆抗体（FasMcab）辅助对植入裸鼠皮下的瘢痕疙瘩组织进行治疗。通过大体观察、常规病理及电镜观察检测瘢痕疙瘩组织的变化。结果 单纯使用腺病毒注射的瘢痕疙瘩组织块体积仅轻度缩小。前期注射Ad—Fas（B）或Ad—Fas（T）后,应用FasMcab作为后续治疗,瘢痕疙瘩组织块均明显缩小,HE染色证实瘢痕疙瘩组织结构遭到破坏,电镜观察发现细胞凋亡证据。结论 重组腺病毒Ad—Fas（B）及Ad—Fas（T）的瘢痕疙瘩基因治疗效果令人满意。为瘢痕疙瘩的治疗提供了新途径。     

携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒AdTPHre-hE对胰腺癌的体内实验研究

目的通过建立裸鼠胰腺癌肿瘤模型,在体内实验中进一步证实携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒AdTPHre-hE的抗肿瘤作用.方法建立AsPC-1胰腺癌细胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,在瘤体内注射AdTPHre-hE治疗,观察肿瘤生长.ELISA法检测裸鼠血清中人内皮抑素浓度,肿瘤组织行Hexon单克隆抗体免疫组化染色及微血管免疫组化染色.结果AdTPHre-hE抑制肿瘤生长的作用显著强于Ad-hE(P＜0.01)和对照组(P＜0.01).随着治疗时间的延长,裸鼠血清中内皮抑素表达量不断增加,明显高于Ad-hE组(P＜0.01)和对照组(P＜0.01).病毒Hexon免疫组化染色显示,AdTPHre-hE治疗组移植瘤内可见片状或弥漫性分布的阳性染色,AdTPHre-hE治疗组瘤组织中微血管密度为16.3±4.3明显少于Ad-hE组的33.8±6.2(P＜0.01)和对照组的36.8±4.6(P＜0.01).结论增殖型腺病毒AdTPHre-hE介导人内皮抑素的表达,具有明显抑制肿瘤细胞生长的作用.     

腺病毒介导的人血管抑素基因治疗胰腺癌

目的观察腺病毒介导的人血管抑素基因对胰腺癌的治疗作用。方法通过病毒重组技术将人血管抑素基因克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中,获得腺病毒滴度达5．5×10~(10) pfu/ ml,观察转染表达后的生物学活性,通过建立裸鼠动物模型(每组数n=15例),分析基因转导后胰腺癌组织中血管抑素的表达情况及对肿瘤血管的抑制作用。结果构建了血管抑素的重组腺病毒载体pCA13-hAG；检测到血管抑素在体外mRNA水平和蛋白质水平表达率分别为87%和81%,得到279 bp电泳条带和38 000大小的蛋白条带；荷瘤裸鼠体内肿瘤体积显著低于对照组(P＜0．05),治疗组MVD为9．85±1．20,两对照组肿瘤微血管密度(MVD)分别为20．35±2．15、17,66±2．34 (P＜0．05)。结论所构建的pCA13-hAG重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的血管抑素,使肿瘤内微血管生成减少,肿瘤细胞增殖减慢,为抗血管生成治疗实体瘤的临床应用奠定基础。     

类固醇类激素联合携带Fas基因重组腺病毒治疗瘢痕疙瘩的体内实验研究

目的应用成功制备的携带人Fas基因的两种重组腺病毒,联合类固醇激素进行瘢痕疙瘩的动物实验研究,判断携带人Fas基因的重组腺病毒与类固醇激素联合治疗瘢痕疙瘩的效果。方法构建瘢痕疙瘩裸鼠模型。使用Ad-Fas(B),Ad-Fas(T)两种构建成功的腺病毒注射及其它辅助治疗手段,实施针对植入裸鼠皮下的瘢痕疙瘩组织的体内治疗方案。通过大体观察,常规病理及电镜观察检测瘢痕疙瘩组织块的变化。结果①单纯使用腺病毒注射后的瘢痕疙瘩组织块体积仅轻度缩小。②前期注射Ad-Fas(B)或Ad-Fas(T)后,使用类固醇激素作为后续治疗因素,其瘢痕疙瘩组织块均明显缩小。③使用腺病毒治疗后,能有效地减少曲安缩松的使用,从而减轻类固醇类激素治疗的副作用。结论①裸鼠为免疫缺陷动物,所以该结果并不能否认病毒的直接治疗作用,在免疫性动物体内直接注射腺病毒的治疗效果尚无结论。②重组腺病毒Ad-Fas(B)及Ad-Fas(T)的瘢痕疙瘩基因治疗的动物实验为瘢痕疙瘩的治疗展示了一条全新的途径。     

双自杀基因重组腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用

目的构建含CD／UPRT双自杀基因的重组腺病毒Ad—CD／UPRT，观察其对人肺腺癌细胞的杀伤作用。方法用0～100感染复数的重组腺病毒转染肺腺癌A549细胞后加入（0～1000）mg／L的5-氟胞嘧啶（5-FC），MTT法检测杀伤效率；将转基因细胞与未转基因细胞按不同比例混合，观察旁观者效应。结果Ad-CD／UPRT转染A549后对细胞生长有显著的抑制作用，细胞杀伤效率随腺病毒滴度及5-FC浓度的增加而增强；转基因细胞占混合细胞10％以上，即可观察到明显的旁观者效应。结论Ad—CD／UPRT联合5-FC对肺腺癌A549细胞有显著杀伤作用。     

多聚乙烯亚胺介导IL-12基因增强裸鼠抗骨肉瘤免疫

目的 :观察以多聚乙烯亚胺 (polyethylenimine ,PEI)为载体 ,体内转染小鼠白细胞介素 12 (inter leukin 12 ,mIL 12 )基因 ,治疗裸鼠骨肉瘤模型的疗效。方法 :以PEI为载体 ,体外转染mIL 12基因入人骨肉瘤细胞 ,并观察此基因表达情况。建立裸鼠骨肉瘤动物模型 ,将PEI包裹mIL 12基因直接注入肿瘤局部 ,检测此基因的蛋白表达情况和小鼠脾脏自然杀伤细胞 (NK)活性。结果 :在PEI/DNA治疗组小鼠的肿瘤局部 ,mIL 12蛋白水平明显升高 ,小鼠脾NK细胞活性增强。结论 :PEI可以成功的将mIL 12基因导入裸鼠骨肉瘤模型 ,mIL 12基因治疗可提高机体的抗肿瘤免疫应答     

TK基因/9-丙氧鸟苷联合mGM-CSF基因治疗胃癌

目的 观察自杀基因ＴＫ对小鼠胃癌的杀伤作用,并联合ｍＧＭ－ＣＳＦ基因,观察免疫反应在增强ＴＫ杀伤性中的作用。方法 应用逆转录病毒方法转导自杀基因ＴＫ,应用脂质体方法转导细胞因子基因ｍＧＭ－ＣＳＦ。观察ＴＫ基因体外对小鼠胃癌６１５小鼠前胃癌（ＭＦＣ）细胞的杀伤性和旁观者效应;体内实验中将病毒上清注入瘤体内,并结合应用其前药９－丙氧鸟苷（ＧＣＶ）和ｍＧＭ－ＣＳＦ基因,分别观察肿瘤的生长情况。通过病理切