黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响

目的 探讨不同剂量的黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞(GMC)增殖的影响,以期探索黄芩苷防治DN的药效机制,为中医药防治DN提供新的视角和实验根据.方法 体外培养大鼠肾小球系统细胞(GMC)并分为9组:正常组(LG 5.5mmol/L)、模型组(HG 25mmol/L)、黄芩苷1组(HG 25mmol/L+黄芩苷3.125μmol/L)、黄芩苷2组(HG 25mmol/L+黄芩苷6.25μmol/L)、黄芩苷3组(黄芩苷(HG 25mmol/L+黄芩苷12.5μmol/L)、黄芩苷4组(HG25mmol/L+黄芩苷100μmol/L)、黄芩苷5组(HG 25mmol/L+黄芩苷50μmol/L)、黄芩苷6组(HG 25mmol/L+黄芩苷100μmol/L)和PKC抑制剂组(HG 25mmol/L+ PKC抑制0.5 nmol/L),每组设平行6孔,培养24h、48h、72h后,应用MTT比色法检测各组GMC增殖情况,倒置显微镜下观察各组GMC生长情况,评价黄芩苷对GMC生长的影响.结果 从各时间点测得的OD值可见,用药组与高糖组比较差异有统计学意义(P<0.05),黄芩苷组与PKC阳性药组比较差异均有统计学意义(P<0.05).从抑制率可见,24h时,除了黄芩苷6组(即给药剂量为100μmol/L)对高糖刺激后GMC增殖有抑制作用之外,其余各组对高糖刺激后GMC增殖均无抑制.48h、72h随着时间增加,各组对高糖刺激后GMC增殖的抑制率逐渐升高,且随着黄芩苷浓度增加抑制率逐渐增高.结论 高糖环境下,体外培养GMC存在异常增殖现象,黄芩苷对高糖刺激GMC增殖有抑制作用,且具有一定剂量效应关系.即抑制率随着黄芩苷浓度的增高而升高,尤其是25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L三组的时间剂量依赖关系更加明显,且在72h的时间点抑制率最高,抑制效果最佳.     

黄芩苷下调NF-κB表达抑制高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的作用

目的研究黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞（GMC）增殖的抑制作用及对NF-κB表达的影响。方法将体外培养的大鼠GMC分为六组：低糖组,高糖组,黄芩苷低、中、高剂量组、氯沙坦组,培养24、48、72 h。实验结束后根据MTT法检测结果,收集细胞并提取核蛋白,用Western blot方法检测各组NF-κB表达情况。结果高糖组在24、48、72 h时间段的吸光值均较低糖组增高,且随培养时间延长而增高明显（P〈0.05）;黄芩苷低、中、高剂量组,氯沙坦组在24 h时间段吸光值均较高糖组高,48、72 h时间段较高糖组低（P〈0.05）。Western blot结果显示,高糖组NF-κB表达量较低糖组增加。而用黄芩苷干预后,GMC中NF-κB表达量较高糖组减少,且随着浓度增加,表达量逐渐减少。结论高糖环境下体外培养的GMC存在异常增殖现象,黄芩苷能抑制高糖诱导的GMC异常增殖,且呈时间、剂量依赖关系,其机制可能与黄芩苷下调NF-κB表达有关。     

黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞缝隙连接蛋白43表达的影响

目的 研究黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）中缝隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）表达的影响.方法 将体外培养的大鼠GMC分为6组：低糖组,高糖组,黄芩苷低、中、高剂量组,蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）抑制剂组.培养72 h后,收集细胞并提取细胞总蛋白,Western-blot法检测黄芩苷对高糖环境下GMC中PKC和Cx43表达的影响,用划痕标记染料示踪技术检测黄芩苷对GMC缝隙链接通讯功能（gap junction intercellular communication,GJIC）的影响.结果 Western-blot结果显示,与低糖组比较,高糖组中PKC蛋白表达量显著增加（P〈0.01）,Cx43蛋白表达量显著减少（P〈0.01）;黄芩苷呈剂量依赖性降低PKC蛋白表达水平,升高Cx43蛋白表达水平.划痕标记染料示踪实验结果显示：与低糖组比较,高糖组GMC的GJIC功能缺乏,未向邻近细胞传输;与高糖组比较,PKC抑制剂组罗氏黄荧光染料向划痕两侧邻近细胞传输的层数较黄芩苷各剂量组明显增多,黄芩苷各剂量组呈剂量依赖性地增加传递的层数.结论 黄芩苷可剂量依赖性地抑制高糖环境下GMC中PKC的异常活化,从而上调Cx43表达,恢复GJIC的功能.     

体外藻酸双酯钠对大鼠肾小球系膜细胞增殖及凋亡的影响

目的　研究藻酸双酯钠 (PSS)对大鼠肾小球系膜细胞 (GMC)增殖及细胞凋亡的影响。方法　采用MTT法检测PSS、甲基强的松龙 (MP)、低分子肝素对GMC细胞增殖的影响 ;采用光镜、荧光镜、流式细胞仪检测GMC细胞凋亡。结果　PSS、MP、低分子肝素均对GMC生长有抑制作用 ;PSS诱导GMC细胞凋亡。结论　PSS在体外可以抑制GMC细胞增殖     

过表达羧肽酶E对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞增殖和凋亡的影响

目的：探究羧肽酶E（carboxypeptidase E,CPE）对高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）增殖、周期及凋亡的影响。方法：PCR法扩增CPE基因片段,将其插入表达载体 pcDNA3.1质粒中以构建重组质粒pcDNA3.1?CPE。将质粒转染GMC细胞,通过蛋白质免疫印迹法检测CPE标签蛋白、增殖标志物细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）以及凋亡标记物Cleaved?caspase?3的表达;采用平板克隆、Cell Counting Kit?8（CCK?8）法以及流式分析法检测过表达CPE对高糖培养的GMC细胞增殖、细胞周期以及凋亡的影响。结果：成功构建CPE过表达的GMC细胞。平板克隆以及CCK?8实验表明,过表达CPE可以抑制GMC细胞的增殖能力。流式细胞学检测表明,与对照组相比,CPE过表达明显促进了细胞凋亡;细胞周期中G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少,差异有统计学意义（P < 0.01）。结论：过表达CPE可以抑制高糖培养的小鼠GMC细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

肌肽对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的影响及机制

目的探讨肌肽(carnosine)对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(rat mesangial cells,RMCs)增殖的影响及作用机制。方法以RMCs为研究对象,分别采用MTT法和BrdU-ELISA法观察肌肽对高糖诱导的RMCs增殖的影响;乳酸脱氢酶(LDH)法检测肌肽对细胞的毒性作用;酶生化法测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)含量及细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性等。结果肌肽可显著抑制高糖诱导的RMCs增殖,在5～30 mmol/L范围内呈一定的浓度依赖效应,且与其抗氧化作用密切相关。结论肌肽通过抗氧化作用抑制高糖诱导的RMCs增殖,且有浓度依赖趋势。     

冬虫夏草对肾小球系膜细胞增殖的影响

目的：观察冬虫夏草菌丝对体外培养的大鼠系膜细胞(MsC)增殖的影响。方法：应用血清药理学,使用氚标胸腺嘧啶([^3H]-TdR)掺入法检测大鼠肾小球MsC增殖。结果：含虫草菌丝血清可抑制MsC的增殖。结论：虫草菌丝可用于肾小球硬化的防治。     

脂联素对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖及粘附分子1表达的影响

目的探讨脂联素（ADPN）对高糖环境下肾小球系膜细胞（MCs）增殖及细胞间粘附分子1（ICAM-1）表达的影响。方法将MCs分为三组：①正常组（5．5mmol／L葡萄糖）,②高糖组（25mmol／L葡萄糖）,③ADPN组（25mmol／L葡萄糖,2．5ug／mlADPN）运用MTT测定（24h,48h,96h）后MCs的增殖情况;再将MCs分为三组：①正常组（5．5mmol／L葡萄糖）,②高糖组（25mmol／L葡萄糖）,⑤ADPN组（25mmol／L葡萄糖2．5,5,7．5,10,15,20ug／mlADPN）,作用48小时后运用ELISA法测定各组MCs上清液中ICAM--1的含量。结果高糖组抑制细胞增殖,加A．ADPN后促进细胞增殖。ICAM--1在高糖组表达较高,加入低浓度ADPN对于ICAM--1表达影响不大,10--20mg／LADPN组和高糖组相比,ICAM--1的表达下降,差异有统计学差异（P〈O．05）,且呈剂量依赖性。姑论低浓度ADPN可以促进MCs增殖;中等以上浓度ADPN可以抑制ICAM--1在Mcs的表达。提示ADPN可能通过阻抑ICAM-1表达发挥对DN的保护作用。     

脂联素对高糖环境下肾小球系膜细胞增殖及粘附分子1表达的影响

目的 探讨脂联素(ADPN)对高糖环境下肾小球系膜细胞(MCs)增殖及细胞间粘附分子1(ICAM-1)表达的影响. 方法 将MCs分为三组:①正常组(5.5 mmol/L葡萄糖),②高糖组(25mmol/L葡萄糖),③ADPN组(25 mmol/L葡萄糖,2.5ug/mlADPN)运用MTT测定(24h,48h,96h)后MCs的增殖情况;再将MCs分为三组:①正常组(5.5mmol/L葡萄糖),②高糖组(25mmol/L葡萄糖),③ADPN组(25mmol/L葡萄糖2.5,5,7.5,10,15,20ug/ mlADPN),作用48小时后运用ELISA法测定各组MCs上清液中ICAM-1的含量. 结果 高糖组抑制细胞增殖,加入ADPN后促进细胞增殖.ICAM-1 在高糖组表达较高,加入低浓度ADPN对于ICAM-1表达影响不大,10～20mg/LADPN组和高糖组相比,ICAM-1的表达下降,差异有统计学差异(P＜0.05),且呈剂量依赖性.结论 低浓度ADPN可以促进MCs增殖;中等以上浓度ADPN可以抑制ICAM-1在MCs的表达.提示ADPN可能通过阻抑ICAM-1表达发挥对DN的保护作用.     

多球壳菌素对激活的大鼠肾小球系膜细胞增生的抑制作用

目的 探讨多球壳菌素（ISP-Ⅰ）对体外激活的大鼠肾小球系膜细胞（GMC）的调控作用。方法 分别采用MTT法及流式细胞术检测IL-1、IL-6对GMC的激活作用及ISP-Ⅰ对激活后GMC增生的抑制作用。结果 MTT法结果显示10U／ml IL-1及1000U／ml IL，6刺激GMC24、48h后，反映细胞增生程度的吸光度（A）值较对照组增高（P〈0．05）；激活的GMC在25～500μg／ml ISP-Ⅰ作用24、48h后的A值较对照组低（P〈0．05）。流式细胞术检测的结果与MTT法一致，即GMC被激活12、24、36h时的细胞增生率高于对照组（P〈0．05）；激活的GMC在100μg／ml ISP-Ⅰ作用下，细胞增生率低于对照组（P〈0．05）。结论 ISP-Ⅰ对激活后的GMC有明显抑制作用。     

紫草素对人胎肾小球系膜细胞增殖、凋亡及细胞外基质的影响

目的：研究紫草素对人胎肾小球系膜细胞(MC)增殖、凋亡及细胞外基质的影响。方法：采用人胎肾细胞培养法、MTT法、流式细胞仪及免疫组化的方法。结果：紫草素0．05、0．10、0．50及1，00mmol／L浓度对培养24、48、72h人MC有明显抑制作用；紫草素明显抑制高糖诱发的人MC细胞凋亡；紫草素0．05、0．10、0．50μg/ml显著抑制系膜基质层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白(FN)及胶原Ⅳ(CoⅣ)的生成。结论：紫草素具抑制人MC增殖、细胞外基质生成及细胞凋亡作用。     

糖肾颗粒对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

[目的]研究糖肾颗粒对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,GMC)增殖的影响,探讨其在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)防治中的意义.[方法]将常规体外培养的GMC分为正常对照组、高糖组、糖肾颗粒高、中、低剂量组及贝那普利组,分别进行相应处理后收集细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同作用时间(24h、48h、72h)下细胞增殖程度.[结果]高糖(30.0mmol· L-1)能明显刺激体外培养的GMC增殖.糖肾颗粒及贝那普利两种药物含药血清对高糖刺激下的GMC增殖有抑制作用,其中糖肾颗粒血清对GMC的抑制作用优于贝那普利血清,且呈一定的时间、剂量依赖性关系.[结论]高糖可促进GMC增殖,糖肾颗粒能明显抑制高糖条件下GMC增殖,从而发挥预防肾小球纤维化及硬化的发生、发展,进而延缓DN的进展.     

内皮素—1对肾小球系膜细胞内游离钙浓度影响

ET－1激发肾小球系膜细胞（glomerularmesangialcell，GMC）内［Ca2 ］i；升高作用分2个时相，即瞬时峰值升高和缓慢持久升高，对峰值升高呈剂量依赖方式，＜10－10mol／L不引起峰值升高，≥10－10mol／L引起峰值升高，且随着剂量增加，幅度增大。维拉帕米对ET－1激发GMC内［Ca2 ］i峰值升高和持久升高均无抑制作用；细胞内储存钙释放抑制剂TMB－8明显抑制峰值升高，但对持久升高无作用；无钙缓含冲液（1mol／LEGTA处理）对峰值升高无作用，但可完全阻止持久升高作用。结果表明ET－1激发GMC内［Ca2 ］i浓度峰值升高是由细胞内储存钙释放介导的，而持久升高是由细胞外钙流入增加引起的。     

肾小球系膜细胞三维立体培养方法的构建

建立一种肾小球系膜细胞三维立体培养系统，该系统可以模拟肾小球系膜细胞在肾小球系膜区的生长环境，并证实在三维立体培养系统中．肾小球系膜细胞在24、48和72h的增殖作用比传统贴壁培养时明显缓慢。     

大鼠肾小球系膜细胞原代培养与鉴定

目的: 原代培养及鉴定大鼠肾小球系膜细胞(GMC),探索分离、培养GMC的最佳条件.方法: 对大鼠双肾灌洗后,筛网滤过分离肾小球,并用Ⅳ型胶原酶消化处理,然后种植法体外培养大鼠肾小球.同时采用免疫细胞化学和免疫荧光技术,检测亚代GMC的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、Ⅷ因子相关抗原抗体的表达,鉴定GMC,并绘制其生长曲线.结果: 种植4 d后,约80%肾小球贴壁,可见卵圆形上皮细胞生长,18 d左右镜下细胞多呈星状或三角形并伴有不规则的突起,21 d后细胞生长密集, 细胞团簇之间形成网络.免疫细胞化学和免疫荧光证实抗α-SMA及抗Vimentin染色阳性,而抗Cytokeratin、抗Ⅷ因子抗体染色为阴性.GMC亚代倍增时间为4 d. 结论: 结果表明,用改良的培养方法成功率高,培养的细胞为大鼠肾小球系膜细胞.     

地骨皮活性成分对高糖致肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质的影响

目的?观察地骨皮中有效成分对高糖刺激的肾小球系膜细胞的增殖以及细胞外基质分泌的影响,研究其对糖尿病肾病的保护机制。方法?体外培养肾小球系膜细胞,分为高糖模型组（葡萄糖浓度为30?mmol/L）,空白对照组（葡萄糖浓度为5.5?mmol/L）,甜菜碱、山奈酚5个浓度剂量组（0.01、0.1、1、10、100?μmol/L）,用MTT法观察系膜细胞增殖情况,ELISA法观察细胞外基质分泌情况。结果?与高糖模型组比较,不同剂量甜菜碱组和山奈酚组,对高糖致肾小球系膜细胞增殖有不同程度的抑制。甜菜碱、山奈酚均能抑制细胞外基质的分泌,与高糖模型组比较有显著性差异（P<0.05~0.01）。结论?地骨皮中有效成分甜菜碱和山奈酚均具有抑制高糖刺激下系膜细胞增殖以及细胞外基质分泌的作用,推测地骨皮中有效成分具有治疗糖尿病肾病的作用。      

精甘天三肽对肾小球系膜细胞FAK及HA表达的影响

目的 观察精-甘-天(RGD)三肽对肾小球系膜细胞(GMC)增殖、粘着斑激酶(FAK)和透明质酸(HA)表达的影响。方法 采用RGD体外诱导培养大鼠GMC,采用MTT法测定细胞增殖、免疫组织化学方法测定FAK表达、放射免疫法测定HA含量。结果 RGD处理后,细胞由梭形变为圆形或卵圆形,并出现脱壁、悬浮。与正常对照组相比,RGD能降低系膜细胞的增殖;RGD 1mmol／L作用24h分别导致FAK表达平均灰度值降低3．10％,HA含量下降5．64％;4mmol／L作用8h及24h分别导致FAK表达平均灰度值降低6．50％和15．95％,HA含量下降6．37％和18．43％。RSD对细胞增殖、FAK及HA表达无影响。结论 RGD肽可使细胞粘附降低,导致增殖力下降,ECM成分分泌减少。     

血尿停颗粒对肾小球系膜细胞及细胞因子的影响

目的探讨中药血尿停颗粒治疗多种以系膜增生为主要病理改变的肾小球疾病的作用机理.方法利用小鼠肾小球系膜细胞(GMC)体外培养技术,采用血清药理学、药物与肝S9共育2种加药方式,观察细胞增殖及白细胞介素-6(IL-6)、内皮素(ET)和乳酸脱氢酶(LDH)含量的变化.结果2种加药方式均显示,血尿停颗粒具有抑制系膜细胞(MC)的增殖及IL-6、ET的产生的作用,细胞毒作用不明显.结论抑制MC增殖及抑制MC产生IL-6和ET可能是血尿停颗粒治疗多种以系膜增生为主要病理改变的肾小球疾病的作用机制之一.