不同细胞因子诱导对树突状细胞体外分化的影响

目的 观察不同细胞因子诱导对于体外培养的树突状细胞(DC)免疫刺激活性的影响.方法 通过1000 U/ml人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和500 U/ml白细胞介素(IL)-4体外诱导的人单个核细胞来源的DC,经1000 U/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α、1 mg/L脂多糖(LPS)、1 mmol/L丁酸钠、细胞因子鸡尾酒法诱导成熟,分别以流式细胞仪、FITC-Dxtran内吞检测、混合淋巴细胞反应(MLR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)检测DC的表面标志、内吞能力、刺激淋巴细胞增殖能力和IL-12分泌的变化.结果 鸡尾酒法诱导下的DC成熟标志显著上调,内吞能力减弱186.74±38.66,刺激淋巴细胞增殖能力增强18.23 ±2.22,并且IL-12的分泌能力增加(656.18±38.52)ng/L,说明其显著促进DC成熟.而丁酸钠诱导下的各项成熟指标均下调,导致DC免疫刺激源性减弱.结论 细胞因子鸡尾酒法是诱导DC成熟的最佳方法;而丁酸钠可以抑制DC成熟,改变DC的免疫状态.

Abstract：

Objective To investigate the immune effect of different cytokines on immature dendritic cells (DC) in vitro. Methods The human monocyte-derived DCs were induced in the presence of recombinant human GM-CSF (rhGM-CSF, 1000 U/ml) and interleukin (IL)-4 (500 U/ml). The effects of tumor necrosis factor (TNF) -α (1000 U/ml) , lipopolysaccharide (LPS) (1 mg/L), the cocktail of cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE2) , and sodium butyrate (1 mmol/L) on the DCs were detected by flow cytometry (FCM), endocytic activity, T cells stimulatory proliferation capacity, and IL-12 production. Results The cocktail of cytokines could up-regulate the major histocompatibility complex (MHC) class Ⅱ and costimulatory molecules of DCs, decrease the endocytic activity 186. 74 ±38. 66, induce a stage of Tcell stimulation 18. 23 ± 2. 22 and promote the T helper cell type 1-skewing factor IL-12 production (656. 18 ±38. 52) ng/L. But the sodium butyrate induced reverse result on DCs compared to cocktail of cytokines. Conclusion The most effective method for inducing dendritic cells maturation was cocktail of cytokines. The sodium butyrate could inhibit the development of mature DCs, resulting in impaired DC function, and modify the outcome of the subsequent immune response.     

丁酸钠增强未成熟树突状细胞表达吲哚胺2,3双加氧酶抑制T细胞增殖

目的 观察丁酸钠诱导的不成熟树突状细胞(DCs)吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)的表达及其在抑制T细胞免疫反应中的作用.方法 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4诱导人单个核细胞来源的未成熟DCs,6 d后分别加入丁酸钠、脂多糖(LPS)和多细胞因子鸡尾酒组合[肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、IL-1β、前列腺腺素E2(PGE2)],24h后收集DCs;流式细胞仪检测Des表型,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR检测IDO mRNA的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-12分泌;混合淋巴细胞培养(MLR)检测各组DCs对同种异体T淋巴细胞增殖的影响.结果 丁酸钠诱导的DCs呈现典型未成熟DCs的特征,低表达CD83、CD80和HLA-DR,分泌IL-12水平低.与对照组比较,丁酸钠组和LPS组DCs的IDO mRNA的表达分别升高了(32.03±4.02)倍和(1.01±0.43)倍,而鸡尾酒组则降低(3.31±1.07)倍,差异有统计学意义(P<0.01);丁酸钠诱导的未成熟DCs采用IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)处理后,可以有效刺激T细胞增殖,但其能力仍低于LPS或鸡尾酒法诱导的成熟DCs.结论 丁酸钠可显著增强未成熟DCs的表达IDO,并且IDO过表达在其抑制T细胞增殖中起重要作用.     

不同诱导方法对人外周血树突状细胞体外成熟的影响

目的探讨不同诱导方式对于体外培养的树突状细胞（dendritic cells,DC）免疫刺激活性的影响。方法通过rhGM-CSF和IL-4体外诱导的人外周血单核细胞来源的DC,分别用肿瘤坏死因子α（TNF-α）、脂多糖（LPS）、细胞因子鸡尾酒法诱导成熟,再以流式细胞仪、FITC－Dxtran内吞检测、MLR、ELISA法检测DC的表面标志、内吞能力、刺激淋巴细胞增殖能力和IL－12分泌的变化。结果在不同方法促进DC成熟中,细胞因子鸡尾酒法诱导下的DC成熟状态最佳,CD83指数表达高达84．87％,IL-12的分泌量[（656．18±38．52ng／L）]高于其他各组,且刺激淋巴细胞增殖能力最强（P〈0．05）。结论细胞因子鸡尾酒法是体外诱导DC成熟的最佳方法。     

抗原负载的树突状细胞体外诱导抗肿瘤免疫的研究

目的 观察抗原负载的树突状细胞(DCs)体外诱导抗肿瘤免疫效应,探讨树突状细胞肿瘤疫苗的制备方法 .方法 以细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4体外诱导人单核细胞来源的树突状细胞,第6天加入肝癌细胞BeL-7402的冻融抗原并以联合细胞因子鸡尾酒法[肿瘤坏死因子(TNF-α)+IL-6+IL-1β+前列腺素E2(PGE2)]诱导成熟,对照组仅以鸡尾酒法诱导成熟.24 h后收获DCs以流式细胞仪检测其成熟表型CD80、CD83、CD86和LHA-DR,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测其IL-12的分泌,噻唑蓝(MTT)比色法检测其刺激淋巴细胞增殖活性,乳酸脱氢酶释放实验检测其诱导的免疫效应细胞对肝癌细胞的特异性细胞毒作用.结果 联合细胞因子可诱导的DCs成熟和IL-12的分泌(P＜0.05),成熟的DCs有较强的刺激淋巴细胞增殖能力;抗原负载组DCs可诱导效应细胞对肝癌细胞BeL-7402的特异性杀伤作用(P＜0.05).结论 抗原负载的DCs可体外诱导特异性抗肿瘤免疫效应,提示以抗原负载的树突状细胞作为肿瘤免疫治疗的方法 是可行的.     

用树突状细胞诱导同种移植免疫耐受的研究

近年来，树突状细胞（DC）被作为一种强有力的潜在工具，通过阻断其抗原提呈功能以及利用某些DC本身诱导免疫耐受的特性，在诱导同种移植免疫耐受的实验性研究中取得了初步效果，本文就这方面的研究现状作一综述。     

IL-12基因修饰树突状细胞体外诱导免疫杀伤肝癌细胞

目的探讨IL-12基因修饰树突状细胞(DC)体外诱导免疫杀伤肝癌细胞的效能及其机制。方法IL-12基因修饰肝癌病人外周血DC(DC-IL-12),ELISA法检测DC-IL-12培养上清中IL-12和IFN-γ水平,以冻融HepG2所获得的肿瘤相关抗原(TAA)刺激DC-IL-12,MTT法检测TAA负载的DC-IL-12刺激同源T淋巴细胞增殖分化能力,细胞毒试验检测DC-IL-12诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)及其上清液对HepG2肝癌细胞株的杀伤作用,ELISA法检测CTL上清液IFN-γ水平。结果DC经IL-12基因修饰后48h分泌高水平IL-12(24·35±5·4)pg/ml及IFN-γ(725±30)pg/ml,均显著高于未转染DC组(P<0·01)。DC-IL-12诱导的CTL及其上清液对HepG2均有显著杀伤作用,杀伤率显著高于未转染DC组,分别为(82·43±8·7)%vs(57·4±4·3)%和(76·45±8·5)%vs(18·23±5·3)%(P<0·01),DC-IL-12诱导的CTL上清液IFN-γ水平显著高于未转染DC组,分别为(1125·0±32·7)pg/ml、(281·3±14·7)pg/ml(P<0·01)。结论IL-12基因修饰增强DC体外诱导自体T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫,其机制与IL-12基因修饰促进DC分泌IL-12、增强T淋巴细胞活化及分泌IFN-γ密切相关。     

不同类型肿瘤抗原致敏的树突状细胞体外诱导前列腺癌特异性CTL的研究

目的:研究肿瘤冻融抗原及弱酸洗脱提取的肿瘤抗原肽分别冲击致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs)体外诱导前列腺癌特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应。方法:采用反复冻融法和弱酸洗脱法,分别获取前列腺癌细胞株PC-3的肿瘤抗原,应用重组人GM-CSF、IL-4体外培养诱导外周血单个核细胞获得DC,并分别负载两种前列腺癌肿瘤抗原,检测其体外激活肿瘤特异性CTL的能力,用LDH释放法检测其对PC-3的体外杀伤效应。结果:用枸橼酸-磷酸盐缓冲液洗脱或反复冻融PC-3(2×107)后获得的肿瘤抗原蛋白含量分别为(312.2±7.9)μg和(963.0±25.3)μg,负载两种前列腺癌细胞抗原的DCs致敏的CTL对PC-3细胞有明显的杀伤作用,而且负载弱酸洗脱提取的肿瘤抗原肽的DCs致敏的特异性CTL具有更明显的杀伤作用[(60.4±5.52)%vs(43.7±4.11)%,P<0.01)]。结论:弱酸洗脱和反复冻融方法都可以有效获取前列腺癌抗原,用于体外致敏DCs后,均具有活化CTL的能力,而且弱酸洗脱提取的肿瘤抗原肽更为有效。     

树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的研究

目的 观察大鼠骨髓来源的树突状细胞(DC)对同种异体肝移植大鼠免疫耐受的影响.方法 用不同细胞因子诱导培养大鼠骨髓来源的成熟DC(mDC)和不成熟DC(imDC),采用形态学观察、表型分析和功能学实验对培养细胞进行鉴定,构建Wistar大鼠和SD大鼠肝移植模型,并于移植前5 d注射到受体大鼠内,研究它们对移植后大鼠肝脏病理及存活时间的影响情况.结果 DC细胞形态不规则,大多数细胞表面有细长树枝状突起,mDC和imDC表面均表达表面分子OX62,而表面分子CD86在imDC表面低表达,在mDC表面高表达.imDC和mDC与淋巴细胞相互作用,发现imDC对淋巴细胞的增殖无明显作用,相反mDC对淋巴细胞的增殖有明显的促进作用.注射imDC的受体大鼠的存活时间显著长于注射mDC的受体大鼠,注射mDC的肝移植大鼠在移植后较早且出现较强的急性排斥反应,而注射mDC的大鼠在移植后16 d才开始出现轻度急性排斥反应.结论 建立了在体外大量扩增大鼠骨髓来源DC的方法,imDC能显著延长受体大鼠肝移植的存活时间.     

用树突状细胞诱导同种移植免疫耐受的研究

近年来 ,树突状细胞 (DC)被作为一种强有力的潜在工具 ,通过阻断其抗原提呈功能以及利用某些DC本身诱导免疫耐受的特性 ,在诱导同种移植免疫耐受的实验性研究中取得了初步效果 ,本文就这方面的研究现状作一综述。     

树突状细胞诱导肝移植免疫耐受新进展

肝移植的最终目标是要达到移植肝和受体之间的免疫耐受,树突状细胞在肝移植免疫耐受的诱导中起着举足轻重的作用。现就树突状细胞在肝移植免疫耐受诱导中的作用进行综述。     

丁酸钠对人肝癌细胞株SMMC-7721的诱导分化作用及其机制

目的 探讨丁酸钠(Sodium Butyrate,NaB)抑制人肝癌细胞株SMMC-7721细胞生长、诱导其凋亡的分子机制.方法 采用噻唑蓝(MTT)比色法、倒置显微镜观察药物对细胞生长的影响并绘制细胞增殖抑制曲线;透射电镜观察细胞凋亡的形态变化;流式细胞术分析细胞周期;半定量RT-PCR方法检测细胞p21WAF1基因mRNA的表达水平;Western blot检测细胞p21WAF1蛋白的表达变化.结果 NaB对人肝癌细胞生长的抑制呈剂量依赖和时间依赖关系.将细胞周期阻滞于G0/G1期,NaB上调p21WAF1 mRNA及蛋白的表达.结论 NaB具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖、诱导其凋亡的作用,这种作用可能是通过上调p21WAF1 mRNA及蛋白完成的.     

吲哚胺2,3双加氧酶在丁酸钠诱导未成熟树突状细胞介导T细胞无能的机制

目的 观察吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)在丁酸钠诱导不成熟树突状细胞(DC)抑制T细胞免疫反应中的作用.方法 通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4体外诱导入外周血来源的DC,第6天加入丁酸钠和不同促成熟因子继续诱导DC分化,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Real-time PCR检测各组IDO mRNA的表达.混合淋巴细胞反应检测各组刺激T细胞增殖能力,进一步在丁酸钠组和对照组分别加入IDO的阻断剂1-甲基色氨酸(1-MT)后了解对T细胞增殖能力的改变.结果 RT-PCR结果显示丁酸钠组DC IDO mRNA表达量(0.84±0.01)高于对照组(0.55±0.01)及脂多糖(LPS,0.53±0.01)等诱导成熟组.Real-timePCR进一步显示与对照组比较,丁酸钠组IDO mRNA的表达升高了约(32.03±4.01)倍.MLR显示丁酸钠组DC刺激淋巴细胞增殖指数(1.53±1.0)低于LPS(9.87±3.8)等成熟组DC,并且采用IDO的抑制剂1-MT可以降低抑制T细胞增殖的能力.结论 丁酸钠诱导下DC可能通过IDO途径降解细胞微环境中的色氨酸来发挥对T细胞增殖的抑制作用.     

Cell-based vaccines for renal cell carcinoma: genetically-engineered tumor cells and monocyte-derived dendritic cells

Initial vaccine developments for renal cell carcinoma (RCC) have concentrated on cell-based approaches in which tumor cells themselves provide mixtures of unknown tumor-associated antigens as immunizing agents. Antigens derived from autologous tumors can direct responses to molecular composites characteristic of individual tumors, whereas antigens derived from allogeneic tumor cells must be commonly shared by RCC. Three types of cell-based vaccine for RCC have been investigated: isolated tumor cell suspensions, gene modified tumor cells and dendritic cells (DCs) expressing RCC-associated antigens. Approaches using genetic modification of autologous RCC have included ex vivo modification of tumor cells or modification of tumors in vivo. We have used gene-modification of allogeneic tumor cell lines to create generic RCC vaccines. More recently, emphasis has shifted to the use of DCs as cell-based vaccines for RCC. DCs have moved to a position of central interest because of their excellent stimulatory capacity, combined with their ability to process and present antigens to both naive CD4 and CD8 cells. The long impasse in identifying molecular targets for specific immunotherapy of RCC is now rapidly being overcome through the use of tools and information emerging from human genome research. Identification of candidate molecules expressed by RCC using cDNA arrays, combined with protein arrays and identification of peptides presented by MHC molecules, allow specific vaccines to be tailored to the antigenic profile of individual tumors, providing the basis for development of patient-specific vaccines.B. Frankenberger and S. Regn made equal contributions to these studies     

丁酸钠对人胰腺癌细胞ASPC-1生长的影响及其机制的研究

目的 探讨丁酸钠对人胰腺癌ASPC-1细胞生长的影响并探讨其作用机制.方法 使用不同浓度丁酸钠处理ASPC-1细胞.MTT法观察肿瘤细胞的增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化;Western印迹法检测细胞内p21、p53、bcl-2、bax蛋白表达的变化,实时定量PCR检测p21和bcl-2的表达.结果 丁酸钠能明显抑制ASPC-1细胞的增殖,其作用具有明显的时间和剂量依赖性.丁酸钠处理24 h后ASPC-1细胞凋亡率明显提高(P＜0.05),S期细胞比例显著降低(P＜0.05),G0/G1期细胞比例显著升高(P＜0.05).p21、bax蛋白表达明显上调(P＜0.05);bcl-2蛋白的表达显著降低(P＜0.05);p53蛋白表达无明显变化(P＞0.05).结论 丁酸钠可以通过诱导胰腺癌细胞的凋亡和周期阻滞而抑制癌细胞生长;其发生机制可能与下调抗凋亡基因bcl-2、上调促凋亡基因bax和肿瘤抑制基因p21的表达有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of sodium butyrate(NaBT) on proliferation of human pancreatic cancer cell line ASPC-1 and explore the possible mechanism. Methods The methylthiazolyl tetrazolium assay (MTT) method was used to detect cell proliferation and draw a curve. The cell apoptosis and cell cycle were determined with flow cytometry. Western blot was used to study the effect NaBT on the pancreatic cancer cells and explore its mechansim. Real-time PCR was employed to assess the expression levels of p53, p21, bcl-2 and cell cycle regulation gene p21. Results After incubation with different concentrations of NaBT for 24 to 72 h, ASPC-1 cell proliferation was inhibited dramatically. NaBT induced an increase of G0/G1 phase cells and a significant decrease in the ratio of S phase cells. The expression of p21 and bax was up-regulated at protein and mRNA level. The expression of bcl-2 was down-regulated at protein and mRNA level. There was no significant difference in the expression of p53 at protein and mRNA level. Conclusion TSA-induced growth inhibition is associated with a block in the G0/G1 phase and apoptosis, which may occur through down-regulating the expression of apoptosis gene bcl-2 and up-regulating the expression of cell cycle regulation gene p21and pro-apoptotic gene bax.     

丁酸钠对膀胱癌细胞生长的影响

目的 观察丁酸钠对膀胱癌细胞生长的影响.方法 不同浓度的丁酸钠干预后,采用~3H-TdR掺入试验比较了膀胱癌BIU-87和E-J细胞的生长曲线变化,并采用流式细胞术研究了丁酸钠对膀胱癌细胞周期的影响.结果 1 mmol/L浓度组在各观察时间点均未显示出对E-J细胞的抑制;5、10mmol/L在各观察点显示出明显的生长抑制作用,各组之间差异有统计学意义(P<0.01);随着丁酸钠浓度的升高,越来越多的BIU-87和E-J细胞细胞被阻滞在G_0/G_1期.结论 丁酸钠对肿瘤细胞增殖的抑制作用具有浓度、时间依赖性,这种作用是通过G_0/G_1期阻滞实现的.     

不同微环境对人骨髓间充质干细胞体外增殖和分化的影响

目的评价不同微环境对人骨髓间充质干细胞（hBMSC）体外增殖和分化的影响。方法采用全骨髓贴壁分离法培养hBMSC,传至第3代后分别在4种微环境下培养：10％FBS组、10％CS组、1g／L植物源重组人血清白蛋白（OsrHSA）组、单纯DMEM组。采用CCK-8比色法测定细胞一周增殖率。以不加成骨诱导液为对照组,实验组添加成骨诱导液后第1周和第2周行碱性磷酸酶染色,第3周和第4周行茜素红染色,评估不同时段各组细胞成骨分化程度。结果采用单纯DMEM组培养hBMsC,细胞增殖率基本不变,后期下降;10％FBS组、10％CS组和1g／LOsrHSA组均能显著提高hBMSC增殖率（P〈O．05）,以10％FBS组效果最好。碱性磷酸酶染色和茜素红染色显示,单纯DMEM组和对照组均未发现钙沉积阳性细胞;10％FBS组、10VooCS组和1g／LOsrHSA组在各阶段均出现阳性染色,随着诱导时间延长颜色明显加深;10％CS组和1g／LOsrHSA组各时间段阳性染色程度明显较10％FBS组弱,10％CS组其次,1g／LOsrHSA组最差。结论细胞外基质微环境对hBMsC生长分化至关重要,含血清的微环境能更好地促进hBMSC增殖及维持hBMSC分化特性。     

异源骨髓间充质干细胞抑制树突状细胞活化杀伤细胞的增殖

目的 通过共培养异源的人骨髓间充质干细胞和树突状细胞活化的细胞因子激活的杀伤细胞(DC-CIK细胞),观察DC-CIK细胞的细胞周期,初步探讨骨髓间充质干细胞的免疫调节机制.方法 采用Ficoll密度梯度离心法分离、培养健康骨髓间充质干细胞和外周血单个核细胞,用多种细胞因子诱导培养外周血单个核细胞中贴壁和悬浮细胞分别为树突状细胞和杀伤细胞.将骨髓间充质干细胞与DC-CIK细胞以1∶5,1∶10,1∶20共培养4 d,采用流式细胞术检测DC-CIK细胞的细胞周期.结果 骨髓间充质干细胞呈长梭形,表达CD+29CD+444双阳性的细胞为93.6%,实验选用第三代后的细胞.在培养第9天树突状细胞表达CD1α人类白细胞Ⅱ类抗原(HLA-DR+)]双阳性细胞数为98.5%.DC-CIK细胞表达CD+3CD+56的细胞数为(29.2±12.2)%.骨髓间充质干细胞使DC-CIK细胞滞留在G0/G1期,且与细胞比例呈正相关.以1∶5,1∶10,1∶20的比例共培养4 d的DC-CIK细胞的G0/G1期和S期分别为(91.0±3.3)%和(2.8±0.6)%,(88.7±3.0)%和(5.1±2.8)%,(83.7±1.7)%和(8.7±3.4)%.对照组(同步化DC-CIK细胞)为(73.4±1.0)%和(17.4±0.6)%.结论 骨髓间充质干细胞可通过抑制DC-CIK细胞的细胞周期而发挥免疫调节作用.