短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)脱毛蛋白酶基因的克隆与序列分析

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)UN-31-C-42菌株是从成都市生活垃圾中分离,并经多次诱变后得到的菌株。其发酵液具有很好的脱毛效果,且对皮革胶原没有损伤。通过对该菌株发酵液中的碱性蛋白酶DHAP的纯化与N′-末端氨基酸序列测定,以及对该序列的同源性分析后,设计出相应引物,用PCR方法扩增了该菌株的碱性蛋白酶基因AP。测序结果表明,该克隆基因全长1588bp,有一个全长1149bp的编码区序列,推测蛋白质序列长383个氨基酸残基,成熟肽分子量为27．8kD。推测的成熟蛋白酶N′-末端具有与DHAPN′-末端完全匹配的序列,说明克隆到的基因为脱毛蛋白酶基因。同源性分析表明,该基因序列与已报道的其他碱性蛋白酶基因有较高的同源性。     

茶尺蠖普通气味结合蛋白基因片段cDNA的克隆与序列分析

根据同源性设计简并性引物,采用RT-PCR方法扩增出了茶尺蠖普通气味结合蛋白GOBP1和GOBP2的基因cDNA片段,大小分别为415 bp和352 bp.测序结果在NCBI中经BLAST搜索,结果表明,两者与已报道的鳞翅目昆虫的气味结合蛋白基因片段或全长的同源性分别为79%~83%和78%~90%.根据两个核苷酸片段推导出的氨基酸残基数分别为138个和117个,均具有6个保守的半胱氨酸位点,符合典型的气味结合蛋白的特点.经BLAST搜索,与其他鳞翅目昆虫GOBP1和GOBP2氨基酸序列的同源性分别为62%~82%和76%~88%.     

嗜酸乳杆菌对蓝靛果汁降酸效果的研究

目的 以蓝靛果汁为原料,选取嗜酸乳杆菌通过发酵降低果汁的酸度,以达到改善果汁口感的目的。方法 研究以果汁降酸率为指标,经单因素和正交试验优化工艺条件,并测定降酸前后果汁中主要有机酸含量变化情况和果汁相关指标。结果 得到的最佳降酸工艺条件为发酵温度34 ℃、菌接种量2.5×107 CFU/mL、初始pH值3.4、葡萄糖添加量（质量分数）3%、胰蛋白胨添加量（质量分数）3%,此条件下果汁的降酸率达到86.32%。采用HPLC法测得果汁中苹果酸、柠檬酸的含量分别下降了49.37%、36.05%,花色苷、还原糖等指标有小幅下降。结论 嗜酸乳杆菌可有效应用于蓝靛果汁降酸处理中,有利于提升果汁的口感。     

洋葱假单胞菌G63脂肪酶基因及其伴侣基因的克隆和同源高效表达

从油污土壤中筛选到一株脂肪酶活性较高的洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)G63.运用PCR的方法从该菌株中克隆了脂肪酶基因(lipA)及其伴侣基因(lipB).该脂肪酶基因开放式阅读框(ORF)为1092bp,编码364个氨基酸残基.经KpnⅠ/HindⅢ酶切,将其克隆到广泛宿主质粒pBBR1Tp载体上,构建成质粒pBBR1-lipAB.通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,转入原宿主菌P.cepacia G63中,构建成lipA基因同源高效表达的基因工程菌.该菌株在连续转接5次,培养45h后质粒保持率为82.6%,适用于规模化发酵生产.摇床发酵表明,工程菌在60h时酶活达到150.63 U/mL,较原始菌株提高3.6倍.     

南极嗜冷假单胞菌7197的分离和无机焦磷酸酯酶(PPase)基因ppa的克隆

从南极普利兹湾深海沉积物中筛选到一株耐冷菌株7197.16S rDNA序列分析表明,该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas).从该菌的全基因组DNA中克隆到编码无机焦磷酸酯酶(PPase)的ppa基因完整的开放阅读框(ORF),其全长为531bp.该基因编码一个由176AA残基组成的分子量预计为19631 Da的PPase蛋白质,其氨基酸序列与Psychrobacter sp.273-4的PPase有97%的相似性,与Neisseria meningitidis Z2491的PPase有79%的相似性,与Mannheimia succiniciproducens MBEL55E的PPase有75%的相似性.     

水稻小GTP蛋白基因Osrab5B基因的克隆和鉴定

用已知遗传图位的BAC克隆片段,对水稻（Oryza sativa)小穗cDNA文库进行筛选,获得一个水稻小GTP结合蛋白（small GTP-binding protein,SGP)的相关序列,序列测定后以该cDNA序列为基础将４个表达序列标记（EST）进行了电子克隆（electronic cloning),根据电子克隆结果设计引物,利用RT－PCR方法获得了一个水稻（Oryza stiva)中尚未鉴定的cDNA克隆Osrab5B,长1016bp。它与龙船海棠属（Mesembryanthemum crystallinum)和百脉根属（Lotus japonicus)命名为rab5B基因（序列登录号分别是AJ006225和Z73939）有着高度同源性（cDNA核苷酸序列ID值分别大于74％和76％）,同属rab家族的一个新的亚族。进而根据Osrab5B的cDNA序列设计引物,扩增得到Osrab5B的基因组克隆,序列分析表明它至少有7个内含子和8个外显子。     

外来入侵生物福寿螺β-actin基因片段的克隆及表达分析

采用RT-PCR的方法首次对入侵我国福寿螺的β-actin基因片段进行扩增、克隆和序列测定,并通过氨基酸序列分析推导与其他相关物种的亲缘关系.结果表明,获得的福寿螺β-actin基因cDNA片段大小为840bp,核酸编码有280个氨基酸序列,与其他物种具有高度的同源性.通过邻接法(NJ)构建的系统发育树显示,福寿螺首先与软体动物聚为一簇,然后与节肢动物聚为一簇,再与脊椎动物聚为一簇.此外,RT-PCR结果显示,β-actin基因在福寿螺的鳃、消化腺、肾和足部肌肉等4个组织内的表达基本一致,具有良好的稳定性.     

基于嗜酸乳杆菌的时间温度指示器的制备及其性能表征

目的 为了监测食品贮藏和运输期间的品质,制备微生物时间-温度指示器(TTI)。方法 选择嗜酸乳杆菌作为时间-温度指示器的微生物,对配制成的9种混合pH指示剂溶液进行筛选,用合适的混合pH指示剂溶液制备TTI,加入不同浓度的嗜酸乳杆菌,在不同等温条件下(5、15、25℃)贮藏检测其指标,以合适的指标参数为响应值探究其动力学与温度依赖性。结果 9种混合pH指示剂溶液中有5种颜色变化较明显,用其中一种制备TTI,以色差值(?E)为响应参数得出其活化能(E_a)为84.9 kJ/mol。结论 5种颜色变化较明显的混合pH指示剂溶液可以作为TTI的指示剂,制备的微生物型TTI有潜力应用于活化能59.9 kJ/mol≤E_a≤109.9 kJ/mol的食品品质指标的货架期预测中。     

牛αsl乳酪蛋白基因上游调控序列的克隆及序列分析

应用ＰＣＲ技术从国内小牛胸腺基因组ＤＮＡ中克隆了１．０ｋｂ牛αｓｌ酪蛋白基因的上游调控序列，并进行了序列分析，发现有少量的缺失或突变，其ＴＡＴＡ框和ＣＡＡＴ框均未发生变异，表明已成功克隆了其启动子序列，这为乳腺定位表达的研究奠定了基础。     

牙鲆促性腺激素释放激素基因cGnRH-II和sbGnRH的克隆与表达特征分析

采用RACE和RT-PCR方法,从牙鲆脑组织中克隆获得了两种牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II(DQ008580)和sbGnRH(DQ074693)的cDNA全基因序列,其长度为607 bp和395 bp,分别编码85和98个氨基酸的GnRH前体,均包含一个信号肽、具有活性的GnRH十肽和一个由蛋白水解位点(Gly-Lys-Arg)连接的GnRH相关肽.氨基酸同源性比较表明,牙鲆促性腺激素释放激素cGnRH-II与其他鱼类的cGnRH-II基因有较高的同源性,如与鲽科鱼类条斑星鲽的相似性为97.6%,但与哺乳类、爬行类和两栖类动物的同源性较低;sbGnRH与条斑星鲽的相似性为86.7%.采用RT-PCR方法分析了两种GnRH基因在成熟牙鲆个体中的表达,结果表明该两基因在脑区、垂体和性腺中皆有表达,但sbGnRH基因的体内表达部位稍多于cGnRH-II.     

WSSV-VAP1基因克隆及在毕赤酵母中的表达

根据WSSV-黏附蛋白(VAP1)基因序列设计了一对引物,在5‘引物和3‘引物中分别引入EcoRI和XbaI酶切位点。经PCR扩增,将VAP1基因克隆至穿梭载体pGAPZαA之GAP启动子下游位点,构建成含α-factor信号肽的重组表达载体,获得的重组质粒pGAPZαA-VAP1经线性化后转入毕赤氏酵母SMD1168菌株,构建成分泌型表达VAP1的酵母工程菌株。SDS-PAGE和Western-blot及结合活性检测分析表明,VAP1基因在该体系中得到成功表达,表达产物与对虾细胞膜具明显的结合活性。     

人血小板生成素（hTPO）的cDNA克隆与序列测定

由于人血小板生成素ｃＤＮＡ的阅读框架较长而且序列中无合适的酶切位点，因此，我们利用一个同义突变创造的ＫｐｎＩ酶切位点人为将ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ分成Ｎ－端和Ｃ－端两个片段。首先利用反转录聚合酶链式反应从人胎肝ｍＲＮＡ中分别扩增出两个ｃＤＮＡ片段，于ＥｃｏＲＩ，ＫｐｎＩ位点分别克隆入测序载体ｐＵＣ１９中。     

栉孔扇贝脂多糖葡聚糖结合蛋白(LGBP)基因的克隆及其特征分析

作为模式识别蛋白的脂多糖葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein,LGBP)在无脊椎动物的免疫系统中发挥着重要作用。本研究以鳗弧菌作为病原感染栉孔扇贝,构建全个体cDNA的质粒文库,用T3引物对文库进行随机测序得到一个667bp的cDNA片段(编号：c1305ct320cn336),它与普通蚯蚓的体腔裂解因子前体基因、海胆的β-1,3-葡聚糖酶、非洲疟蚊的革兰氏阴性细菌结合蛋白等有同源性。用T7引物对该克隆测序得到其3’末端。通过SMART-RACE技术克隆得到该克隆的全长cDNA序列。栉孔扇贝LGBP基因由1850个核苷酸组成,它有一个poly A尾巴,编码一条440个氨基酸的多肽。该多肽的分子量估计为47159．076Da,等电点为5．095。推导的氨基酸序列与蓝虾、斑节对虾、海胆、非洲疟蚊、淡水螫虾、普通蚯蚓及普通红蚯蚓等无脊椎动物模式识别蛋白具有高度的同源性。经用Garnier法预测,栉孔扇贝LGBL的二级结构包含螺旋构象10％,折叠片构象17％,转角构象21％,无规则卷曲53％,各种构象所占比例与普通红蚯蚓的体腔裂解因子前体相近。     

RP2突变体RP2-dser6的克隆和表达

视网膜色素变性是遗传性视觉损害以致失明的最常见原因之一,ＲＰ２是最近定位克隆的一个视网膜色素变性基因。为研究突变ＲＰ２蛋白与正常ＲＰ２蛋白的空间结构的差异及其对功能的影响,用突变的寡聚核苷酸引物自重组质粒ｐＥＴＲＰ２ ＰＣＲ扩增得到突变的ＲＰ２－ｄｓｅｒ６基因,克隆至ｐＥＴ１１Ｃ载体中,转化大肠杆菌ＢＬ２１菌株,重组子经序列分析鉴定后,在３７℃诱导Ｒ２－ｄｓｅｒ６突变蛋白表达,５ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰ     

人类遗传病的家系收集疾病基因定位克隆与疾病基因功能的研究

介绍了中国医学遗传学国家重点实验室在遗传病家系收集、疾病基因定位、疾病基因克隆和疾病基因功能研究方面的研究工作。用细胞遗传学G显带技术于1975年发现了一条与鼻咽癌相关的标记染色体t(1:3)(q44;p11);1981年将睾丸决定基因（TDF）定位于Yp11.32带;1991年以来收集遗传病家系345种共590个;1996年用显微切割、PCR、微克隆技术克隆了EXT2基因;1998年用基因家族－侯选疾病基因克隆方法克隆了遗传性神经性耳龙聋基因GJB3;1999年用连锁分析和全基因组扫描将一种遗传性弥漫性浅表性光敏性汗孔角化症定位于12q23.2带,并在基因功能研究中发现了一个新的细胞内转运蛋白。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

鳗弧菌溶血素基因的克隆及突变株的构建

PCR扩增出鳗弧菌M3溶血素基因的保守区序列,根据保守区序列设计引物,利用反向PCR和巢式PCR扩增出溶血素基因的部分序列,结合构建的鳗弧菌M3的基因组文库,克隆出溶血素基因的全长序列。根据基因推测的氨基酸编码序列与已发表的血清型为A的鳗弧菌PT84057有86％的相似性。用自杀质粒对鳗弧菌M3染色体上的溶血素基因进行了插入突变,将突变株对金鱼进行肌肉注射,结果发现,突变株的毒力没有发生显著的变化,证明所克隆的溶血素基因对鳗弧菌M3的毒力没有直接的贡献。     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。