培养神经元及肝细胞蛋白质样品制备方法的比较研究

目的 :优化神经元和肝细胞蛋白样品的制备方法 ,以提高双向电泳分析结果的正确性和可靠性。方法 :采用不同的细胞裂解液在不同的裂解条件下提取培养神经元或肝细胞的全细胞蛋白质 ,考马斯亮蓝G - 2 5 0测定蛋白质含量 ,SDS -PAGE、双向电泳对蛋白质进行电泳分离。结果 :蛋白质含量测定及电泳图谱的对比分析可见 ,用酶消化法和机械收集法所得蛋白质样品含量均较直接裂解法低 ;蛋白质抽提液中还原剂及去污剂的不同选择对结果的影响较大。结论 :采用培养瓶中细胞直接裂解法较酶消化或机械收集法收集细胞再提取蛋白质更为有效 ,还原剂TBP有利于提高蛋白质双向电泳结果的质量 ,在去污剂的使用方面神经元裂解宜采用 4 %CHAPS ,而肝细胞裂解则宜采用 2 %TritonX - 10 0。     

改良Lowry法和Bradford法测定蚯蚓提取物中蛋白质含量的比较

目的 寻找精确反映蚯蚓提取物中蛋白质含量的测定方法。方法 采用改良Lowry法和考马斯亮蓝染料结合法（Bradford法）测定蚯蚓提取物蛋白质含量；再使用两法测定标准牛血清白蛋白（BsA）水溶液在碱性蛋白酶水解前与后的蛋白质含量。结果 在测定蚯蚓提取物中蛋白质含量时，改良Lowry法的测定结果明显高于Bradford法。未进行酶解的BSA水溶液，两法测定的蛋白质含量相当；使用改良Lowry法，BSA水溶液酶解前与后的蛋白测定值相近；而使用Bradford法时，测定BSA水溶液酶解后蛋白质含量的测定值较酶解前出现大幅下降。结论 测定多肽含量多的生物样品中蛋白质含量时，改良Lowry法更为精确。由于蚯蚓提取物中大量多肽成分的存在，故对测定其蛋白质含量时，改良Lowry法能够更加精确、真实地反映蚯蚓提取物的蛋白质含量。     

不同方法对苦瓜核糖体失活蛋白的 PEG化学修饰后蛋白浓度测定的差异?

目的：探究 PEG 化学修饰对4种常用蛋白浓度测定方法的影响。方法采用福林-酚试剂法(Lowry 法)、二喹啉甲酸法(BCA 法)、考马斯亮蓝法(Bradford 法)和紫外分光光度法(UV 法)分别测定样品中α-苦瓜素和抗人类免疫缺陷病毒植物蛋白 MAP30经 PEG 修饰前、后的蛋白含量;并用 Lowry 法和 BCA 法对低浓度游离 PEG 修饰前、后的样品蛋白含量进行测定。结果发现考马斯亮蓝不与样品发生颜色反应,PEG 修饰后会使UV 法测定值变大,Lowry 法测定值略有变大,BCA 法基本不受影响;低浓度的游离 PEG 对测定方法无影响,但高浓度的 PEG 会吸附 Folin-酚,形成黄色絮状物。结论PEG 化学修饰对蛋白浓度测定方法影响最小的为 BCA 法, Lowry 法最灵敏,Bradford 法不适用;而 PEG 化学修饰会使 UV 法测定值增大20%~30%,可作为快速测定时的校准参考。     

快速测定微量蛋白质的方法

随着生化技术的日益发展,越来越需要对微量蛋白质进行快速定量。劳里(Lowry)蛋白质测定法是目前最经典的方法之一,但根据需要产生了一些改良法,而仍费时,操作也较繁琐,并有许多试剂干扰劳里法的测定结果。最重要的缺点是它不能用于测蛋白含量在10μg以下的样品,因此在实验工作中受到限制。为此我们参照Bradford所     

细胞裂解液对蛋白质定量方法的影响

目的:观察不同细胞裂解液对Bradford法和bicinchoninic acid(BCA)法的影响,以确定适合蛋白质组学研究中细胞全蛋白含量的定量方法。方法:采用Bradford法和BCA法测定牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)样品溶液,样品BSA溶液分别由双蒸水和不同裂解液(荧光差异双向凝胶电泳裂解液、三种传统双向凝胶电泳裂解液)配制;然后,采用这两种方法测定上述裂解液所提取的细胞全蛋白样品;采用Bradford法定量反复冻融、不同比色杯和不同时期标准曲线下的样品。结果:各细胞裂解液对Bradford法均有显著性影响,使所定量的BSA浓度普遍偏高1.2至2倍,但定量值可随着加样浓度的增加而增加(r=0.989~0.996,P<0.05);各裂解液对BCA法也均有显著性的干扰,多数定量结果超出仪器读数范围;对于同批全蛋白溶液样品,BCA法的定量结果与Bradford法相比可有千倍差异;反复冻融后蛋白浓度变化统计学上无显著性差异,但有下降趋势,不同比色杯和不同时期标准曲线对Bradford法无显著影响。结论:Bradford法是蛋白质组学中细胞全蛋白定量的较适方法,但需根据具体实验进行优化。     

水的酸碱度对Bradford法检测蛋白质含量的影响

目的探讨水酸碱度的变化对Bradford法检测蛋白质含量的影响。方法用pH分别为4.0(pH=4.0组)、7.0(pH=7.0组)和10.0(pH=10.0组)的双蒸水配置Bradford法所需要的试剂,绘制标准曲线,检测标准蛋白浓度,比较水的酸碱度的变化对标准曲线的影响。结果pH=4.0组和pH=7.0组的标准曲线拟合度较pH=10.0组标准曲线拟合度明显增高;pH=4.0组和pH=7.0组检测的蛋白质含量与已知蛋白浓度相比差别无统计学意义(P>0.05);pH=10.0组检测蛋白质的含量与已知蛋白浓度、pH=7.0组和pH=4.0组相比差别均有统计学意义(P<0.05),pH=7.0组和pH=4.0组检测蛋白质含量的准确性高于pH=10.0组。结论双蒸水酸碱度的变化可以影响Bradford法检测蛋白质含量的精确度。     

人源多能干细胞体外定向诱导分化为肝细胞

目的: 探索人源诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells,hiPSCs）在体外二维条件下诱导分化生成肝细胞的条件,并初步探讨三维条件下 hiPSCs 的肝细胞诱导分化。方法: 通过测定4种诱导培养基中白蛋白和甲胎蛋白含量,筛选诱导分化的最佳方案。用筛选出的最优培养基对hiPSCs进行二维培养,采用免疫荧光法、蛋白质印迹法检测诱导后的细胞中肝脏标志蛋白的表达,采用酶联免疫吸附法检测肝细胞功能相关蛋白的含量;对hiPSCs进行三维培养,用酶联免疫吸附法对比二维与三维条件下肝细胞功能,并用 HE 染色法观察三维条件下形成细胞的形态。结果： 二维条件下诱导分化23 d,倒置显微镜下细胞呈典型的肝细胞形态;免疫荧光法、蛋白质印迹法检测到诱导分化后的细胞阳性表达肝脏特征蛋白（甲胎蛋白、白蛋白、角蛋白CK8、角蛋白CK18、SOX17）,且与胚胎干细胞来源肝细胞（hESCs HEPs）内含量相近;酶联免疫吸附法测定结果显示,诱导形成的肝细胞具有正常肝细胞功能,表明hiPSCs已分化为肝细胞;HE染色结果显示三维条件下诱导形成的细胞具有明显双核,呈现典型肝细胞形态;酶联免疫法测定结果显示,三维条件下,诱导形成的肝细胞功能没有受到损伤,仍具有正常肝细胞功能。 结论： 在二维与三维培养体系下,采用最佳诱导分化方案,hiPSCs 能够被诱导分化为肝细胞,且表达肝脏相关蛋白,并具有正常肝细胞功能。     

N-V蛋白酶含量检测方法的准确度评价

目的：采用多种方法测定N-V蛋白酶含量,并比较实验结果,选择出最适合N-V蛋白酶含量测定的方法。方法：从沙蚕体内提取的N-V蛋白酶,以凯氏定氮法为基准方法,采用考马斯亮蓝法、Lowry法和紫外吸收法测定N-V蛋白酶的含量。结果：考马斯亮蓝法得到N-V蛋白酶含量为(5.150±0.028)g·L^-1,紫外吸收法A₂₈₀-A₂₆₀)测得蛋白酶含量为(5.202±0.001)g·L^-1,这两种方法均与凯氏定氮法测得的结果(5.164±0.013)g·L^-1存在较小差异; Lowry法测得的结果为(1.12±0.014)g·L^-1,明显偏低,存在较大差异。结论：凯氏定氮法、考马斯亮蓝法和紫外吸收法(A₂₈₀-A₂₆₀)均可测定N-V蛋白酶含量。但N-V蛋白酶不适合采用Lowry法进行测定。     

乳鼠皮层神经元原代培养与观察

目的:通过原代培养乳鼠皮层神经元,为脑血管疾病的研究提供实验模型。方法:酶消化法原代培养出生1天Wistar乳鼠的皮层神经元,利用免疫细胞化学和免疫荧光方法进行鉴定。结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长。免疫细胞化学染色显示神经元特异性烯醇化酶阳性细胞达85%,免疫荧光显示胶质细胞酸性蛋白阳性细胞达15%。结论:酶消化法原代培养乳鼠皮层神经元是一种可靠、稳定的获得神经元的方法。     

乳兔和成年兔肝细胞体外分离及培养的比较研究

目的 研究比较体外分离培养乳兔和成年兔肝细胞增殖活性及功能。方法 采用非灌注胶原酶消化法分离乳兔和成年兔肝细胞,比较细胞产率和细胞活率,均采用DMEM培养液（含10%胎牛血清）培养,计数法观察原代细胞增殖变化,MTT法观察传代细胞增殖情况,检测培养液中白蛋白含量变化。培养过程采用相差显微镜进行形态学观察,培养细胞采用PAS染色法鉴定。结果 分离收获乳兔肝细胞较成年兔肝细胞数目多,活率高。培养过程中,乳兔肝细胞较成年兔肝细胞折光性好,生长快,增殖能力强,培养液上清蛋白含量高并且增长速度较快,具有统计学意义。PAS染色观察,乳兔和成年兔肝细胞胞质中充满大量糖原颗粒,两者差异无显著性。结论 乳兔肝细胞比成年兔肝细胞,更加适合体外培养研究。     

异丙酚对缺氧复氧后培养海马神经元nNOS的影响

目的 观察异丙酚对培养海马神经元缺氧复氧后损伤反应的影响.方法 培养12d海马神经元,随机分为正常对照再培养24h组(Nor组)、缺氧4h后复氧24h组(Ano组)、加异丙酚500μmol/L缺氧4h后复氧24h组(Pro组).采用MTT法测定细胞存活率,免疫组化方法 测定nNOS蛋白含量,应用流式细胞仪测定神经元凋亡率.结果 缺氧后Ano组nNOS蛋白表达及细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),加入异丙酚后能减少nNOS蛋白含量(P＜0.01)和细胞凋亡率(P＜0.05),Pro组细胞存活率较Ano组增加(P＜0.05),但与Nor组比仍下降(P＜0.05).结论 异丙酚能提高体外海马神经元的抗缺氧能力,减少nNOS蛋白过度表达和细胞的凋亡.     

应用蛋白质组分析法初步探讨胆囊收缩素在皮质神经元中的信号转导途径

目的:通过应用蛋白质组学的方法与技术,对八肽胆囊收缩素(octapeptite cholecystokinin,CCK8)作用于乳小鼠皮质神经元后蛋白质磷酸化状态进行分析,为初步探讨胆囊收缩素在皮质神经元中的信号转导途径提供依据.方法:培养乳小鼠皮质神经元,掺入32P-NaH2PO4(2.03×105Bq/ml)2h,实验组及对照组分别加入CCK8和无磷培养基进行培养,收集细胞,提取蛋白,蛋白含量测定.双向电泳分离蛋白,放射自显影获得磷酸化蛋白质的电泳图谱.结果:①对蛋白质组分析法中各个环节实行了筛选及优化,得到比较清晰的放射自显影图谱.②由放射自显影图谱可见,与CCK8信号转导相关的磷酸化蛋白质大约有46个,包括了多种蛋白激酶、细胞膜受体、胞内信号分子、转录因子等.结论:蛋白质组学的方法与技术可以行之有效的应用于信号转导途径中蛋白质磷酸化状态的分析.根据神经元蛋白质磷酸化状态分析的结果,可推测CCK8在皮质神经元的信号转导途径可能包括肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径等.     

体外培养大鼠皮层神经元和星形胶质细胞氧糖剥夺后DDR1的表达情况

目的:探讨DDR1蛋白在氧糖剥夺后的神经元细胞及星形胶质细胞中的表达情况,推测可能机制。方法:采用SD孕鼠的胚鼠皮层培养神经元,采用新生SD大鼠皮层培养星形胶质细胞。建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型并随机分为神经元正常对照组、神经元OGD组、星形胶质细胞正常对照组和星形胶质细胞OGD组。噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞活性;免疫荧光染色及Western blot方法检测各组DDR1的表达情况。结果:与正常对照组相比,OGD组细胞形态发生明显改变,MTT法测得细胞活性值降低;与神经元正常对照组相比,神经元OGD组的DDR1蛋白表达水平增加(P<0.05);与星形胶质细胞正常对照组相比,星形胶质细胞OGD组的DDR1蛋白表达水平无明显增加(P>0.05)。结论:OGD处理可诱导DDR1蛋白在大鼠皮层神经元中的表达,提示DDR1蛋白可能参与OGD后细胞凋亡等病理生理过程。     

保健食品荣骨胶囊中蛋白质含量测定

目的:对保健品荣骨胶囊选择蛋白成分作为含量测定指标的研究.方法:采用紫外分光光度法,以牛血清蛋白作为对照品,进行含量测定.结果:荣骨胶囊中蛋白质为29.1％.结论:此方法操作简便,测得样品含量稳定,可作为荣骨胶囊含量测定方法.     

香萱解郁方对血清剥夺诱导HT22细胞损伤模型的神经保护作用

探讨香萱解郁方含药血清对血清剥夺致小鼠海马神经元HT22细胞损伤模型的影响。方法 采用血清剥夺培养HT22细胞建立神经损伤体外模型,实验分为对照组、模型组和中药组［中药组A（含药血清15%浓度）、中药组B（含药血清20%浓度）］,各组血清剥夺12 h后,通过CCK8法检测各组细胞活力,确定15%浓度含药血清干预后细胞的存活率最高,设定为后续实验中药组的药物浓度。免疫荧光染色法检测神经元特异性微管蛋白（β-Tubulin Ⅲ）在各组中的表达,蛋白质免疫印迹法及qPCR法检测脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白及其mRNA在各组中的表达。结果 在加药后培养12 h,中药组的细胞活力明显高于对照组与模型组（P＜0.001）。培养24 h,模型组细胞活力较对照组明显下降（P＜0.001）,中药组较模型组明显提高（P＜0.001）。培养36 h,模型组细胞活力较对照组显著下降（P＜0.001）,中药组较模型组明显提高（P＜0.001）。模型组BDNF蛋白含量及 BDNF mRNA表达量较对照组显著降低（P＜0.05,P＜0.001）,模型组少数神经元长出突起;中药组BDNF蛋白含量及BDNF mRNA表达量较模型组显著增加（P＜0.05）,中药组HT22细胞轴突突起长度和分支增加,β-Tubulin Ⅲ阳性表达明显增多。结论 香萱解郁方含药血清对血清剥夺诱导小鼠海马神经元HT22细胞损伤具有神经保护作用,可能与促进BDNF蛋白表达有关     

HPLC法预测盐酸丁卡因溶液的稳定性

目的:测定20 g/L盐酸丁卡因溶液的有效期。方法:将样品在不同的温度下进行恒温加速试验,采用高效液相色谱法测定含量,初均速法预测样品有效期。结果:样品的有效期为13个月。结论:该方法稳定、可靠。     

不同取材来源肝细胞体外培养的比较

目的：比较体外培养正常成年大鼠,大鼠乳鼠及人胎肝细胞的生物学性能,方法：采用不同的分离方法获取肝细胞进行体外培养,台盼蓝染色法测定细胞活率,MTT法检测细胞增殖活力,通过检测白蛋白分泌反映肝细胞的功能,结果：人胎肝细胞生长活力和蛋白合成功能最佳,乳鼠肝细胞次之,乳鼠肝细胞较人胎肝细胞易传代,成年大鼠肝细胞分离操作方便,但在体外存活时间较短。结论：不同取材来源的肝细胞体外培养性能有显著性差异（P＜0．05）。     

异丙酚对缺氧复氧后培养海马神经元的抗损伤影响

目的观察异丙酚对培养海巴神经元缺氧复氧后损伤反应的影响.方法培养12d海巴神经元,随机分为正常对照组(Nor组)、缺氧4h后复氧24h组(Ano组),加异丙酚500μmoL/L缺氧4h后复氧24h组(Pro组).MTT法测定细胞存活率及用流式细胞仪测定C-fos含量和神经元凋亡率.结果经流式细胞仪测定显示,缺氧后Ano组G-fos蛋白表达的λm值及细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),Pro组能减少阳性率的改变,λm值和细胞凋亡率较Ano组减少(P＜0.05),但与Nor组仍有差异(P＜0.01).MTT法测定的细胞存活率同凋亡的测定结果一致.结论异丙酚能提高体外海马神经元的抗缺氧能力,减少C-fos蛋白过度表达和细胞的凋亡.     

乳小鼠培养肝细胞蛋白质双向电泳技术的建立

目的 :建立培养乳小鼠肝细胞蛋白质的双向电泳技术。方法 :取乳小鼠肝脏组织 ,进行肝细胞原代培养 ,提取肝细胞蛋白 ,以固相pH梯度 (IPG)等点聚焦为第一向 ,垂直SDS -PAGE为第二向进行双向电泳 ,并对样品处理方式、蛋白上样量、IPG等电聚焦和SDS -PAGE电泳参数设置、凝胶浓度等关键因素和环节进行了比较研究。结果 :通过实验条件的筛选和优化获得了较满意的双向电泳图谱。结论 :本文建立乳小鼠双向电泳分离技术 ,具有较高的分辨率和重复性 ,为研究肝脏不同条件下特异性蛋白的表达及分子标记奠定了基础     

不同方法培养大鼠肺动脉平滑肌细胞的差异

目的比较酶消化法、组织贴块法所培养大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMC)的生长曲线、蛋白质含量、胞内[Ca2 ]含量上的差异性,探讨不同方法是否可以用于同一系列的信号通路研究.方法酶消化法、组织贴块法分别培养PASMC,经过纯化以及免疫组化鉴定后,采用改良Lowry法测定蛋白质含量,采用荧光指示剂法测定胞内[Ca2 ]含量,光镜下观察生长曲线.结果两种方法均顺利建立了纯PASMC系,但是在生长曲线和蛋白质含量上存在一定程度的差异,在胞内[Ca2 ]含量上差异有显著性意义(P＜0.05).结论在同一系列的信号通路研究中应该尽量采用其中一种细胞培养方法.