腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染海马神经干细胞：影响神经干细胞增殖及在缺氧环境下的凋亡

背景:随着胚胎和成体神经干细胞的成功分离、培养、及体外定向诱导分化等技术的成熟，移植神经干细胞用于治疗各种缺血性脑血管病、帕金森病、脊髓损伤、阿尔茨海默病成为可能。但移植后干细胞的存活与缺血缺氧区细胞凋亡密切相关。xbp-1是在内质网应激的未折叠蛋白反应阶段表达的一种重要的效应转录因子，被证实对细胞生存、分化及抗凋亡有重要的作用。 目的:将基因XBP-1通过重组腺病毒转染胚鼠海马神经干细胞，并观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下是否具有抗凋亡作用。 设计、时间及地点: 随机、对照设计，在吉林大学第一医院神经内科实验室，2008年9月到2009年11月完成。 材料:E16SD孕鼠（孕15天）由吉林大学动物实验中心提供，重组腺病毒包装xbp-1基因及增强绿色荧光蛋白（EGFP）由广州易超医学试剂科技公司代为完成。β-actine、grp78、xbp-1、bcl-2、bax、EDEM抗体购自santa cruz公司，二抗、BSA购自武汉意德公司，DMEM/F12高糖培养基、胎牛血清购自长春博德生物技术有限责任公司，凯基Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，CoCl2购自sigma公司，lipo2000其他试剂为国产分析纯化。 方法: 取El6 SD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测，以及传代和扩增。将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞，得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞，通过细胞计数和MTT比色法检测细胞增殖情况。再用CoCl2诱导胚鼠海马神经干细胞缺氧模型，收取蛋白，通过western blot检测内质网应激和凋亡相关蛋白的表达变化，流式细胞仪检测干细胞凋亡情况。 主要结果检测: MTT技术检测细胞增殖，western blot检测蛋白质表达水平，流式细胞术检测细胞凋亡。 结果: XBP-1基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞与对照组细胞相比，细胞增殖速度明显增加。在缺氧条件下内质网应激标志物如grp78表达增加，xbp-1靶基因EDEM表达水平上升，促凋亡分子bax水平下降，抗凋亡分子bcl-2水平上升。通过流式细胞术检测提示细胞凋亡减轻。 结论: 重组腺病毒可以成功将XBP-1基因导入胚鼠神经干细胞中，转染后的NSCs增殖速度加快。缺血缺氧下，XBP-1基因在NSCs中过表达，可以引起grp78和EDEM表达增加、bax水平下降、bcl-2水平上升，细胞凋亡率下降，抗凋亡作用较为明显，为干细胞移植治疗神经系统损伤提供了实验理论基础。