| Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用 |
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| 引用本文： | 贾中发,;马琳,;和祯泉,;周瑜,;孙涛,;崔建奇.Purα基因过表达和RNAi慢病毒载体的构建及应用[J].宁夏医科大学学报,2014(6):620-624. |
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| 作者姓名： | 贾中发 ;马琳 ;和祯泉 ;周瑜 ;孙涛 ;崔建奇 |
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| 作者单位： | [1]宁夏医科大学基础医学院,银川750004; [2]宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室,银川750004 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金（81260197）,973基金（2012CB722408）作者简介：贾中发,男,江西人,在读硕士研究生,从事医学遗传学研究. |
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| 摘 要： | 目的 构建Purα基因过表达以及SiRNA慢病毒表达载体,通过包装病毒,以用于神经系统细胞感染及原代培养神经元的基因操作.方法 1）过表达载体的构建：本实验使用pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体,PCR扩增Purα全长基因,然后亚克隆到pCDH载体相应的多克隆位点之中,进行酶切和测序鉴定;2）ShRNA慢病毒表达载体的构建：根据shRNA的特征,设计shR-NA的DNA序列以及其反向互补序列,然后合成并克隆到慢病毒载体pLKO.1-puro的相应位点中.3）慢病毒包装和滴度测定：将克隆好的pCDH-Purα和pLKO.1-puro-shRNA载体和病毒包装质粒pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.2 dvpr按相应的比例转染到293FT细胞中,48h后收集上清液,纯化、浓缩,进行滴度测定.结果 测序结果证实所插入片段相位正确,转染后通过RT-PCR和Western blot证实过表达组Purα基因表达增高,而沉寂组的Purα表达抑制,达到实验设计要求,可以用于实验研究.结论 利用本方法可以快速地进行目的基因的基因操作,省时、节约,与同类型的方法比较,具有较大的优越性,可以在实验中推广应用.
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| 关 键 词： | Purα 慢病毒表达载体 RNA沉寂 基因过表达 基因操作 |
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