靶向沉默Notch1基因对人非小细胞肺癌干细胞增殖和凋亡的影响

目的研究靶向沉默Notch1基因对人非小细胞肺癌干细胞增殖和凋亡的影响。方法选取人肺癌A549细胞和SPC-A-1细胞,分为空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组,Nc-shRNA组为阴性对照RNAi慢病毒组,Notch1-shRNA组为Notch1抑制RNAi慢病毒组。采用慢病毒介导的shRNA干扰技术靶向沉默Notch1基因,实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blotting验证Notch1基因的沉默效果;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和成球实验检测细胞增殖能力;采用Annexin V/7-AAD 双染法检测细胞凋亡情况;采用Western blotting检测增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)以及Notch1下游基因Hes-1的表达情况。结果 qRT-PCR结果显示A549细胞和SPC-A-1细胞中空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组Notch1相对表达量分别为1.000±0.000、0.937±0.025、0.490±0.036和1.000±0.000、1.077±0.070、0.373±0.038,差异均具有统计学意义(F=359.707,P<0.001;F=210.455,P<0.001),进一步两两比较,两种细胞中Notch1-shRNA组Notch1相对表达量明显低于Nc-shRNA组(均P<0.05);Western blotting检测A549细胞和SPC-A-1细胞中Notch1蛋白表达的结果与mRNA结果一致。MTT实验显示A549细胞球空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组在24 hA值分别为0.209±0.005、0.219±0.009、0.159±0.006,48 h A值分别为0.293±0.004、0.302±0.004、0.205±0.005,72 h A值分别为0.450±0.003、0.430±0.012、0.348±0.017,差异均具有统计学意义(F=79.487,P<0.001;F=508.664,P<0.001;F=57.156,P<0.001),进一步两两比较,24、48、72 h Notch1-shRNA组增殖能力明显低于Nc-shRNA组(均P<0.05);SPC-A-1细胞球空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组在48 h A值为0.438±0.022、0.412±0.015、0.364±0.010,72 h A值为0.540±0.016、0.519±0.009、0.438±0.019,差异均具有统计学意义(F=15.667,P=0.004;F=37.299,P<0.001),进一步两两比较,48、72 h Notch1-shRNA组增殖能力明显低于Nc-shRNA组(均P<0.05)。空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组A549细胞成球直径分别为(149.667±6.506)μm、(136.667±7.095)μm、(86.676±7.638)μm,差异具有统计学意义(F=65.940,P<0.001);SPC-A-1细胞成球直径分别为(118.667±6.658)μm、(128.000±7.000)μm、(60.675±4.509)μm,差异具有统计学意义(F=105.372,P<0.001);进一步两两比较,两种细胞Notch1-shRNA组成球大小明显小于Nc-shRNA组,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。流式细胞术检测A549细胞和SPC-A-1细胞空白对照组、Nc-shRNA组、Notch1-shRNA组凋亡率分别为(0.489±0.014)%、(0.633±0.021)%、(1.683±0.221)%和(1.323±0.194)%、(1.690±0.188)%、(3.017±0.356)%,差异均具有统计学意义(F=77.660,P<0.001;F=32.200,P=0.001),进一步两两比较,两种细胞中Notch1-shRNA组凋亡率明显高于Nc-shRNA组(均P<0.05)。Western blotting显示A549细胞空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组3组间PCNA、Bcl-2、Hes-1表达差异均具有统计学意义(F=155.343,P<0.001;F=22.576,P=0.002;F=70.108,P<0.001 ),SPC-A-1细胞空白对照组、Nc-shRNA组和Notch1-shRNA组3组间PCNA、Bcl-2、Hes-1表达差异均具有统计学意义(F=49.419,P<0.001;F=28.090,P=0.001;F=12.040,P=0.007),进一步两两比较,两种细胞PCNA、Bcl-2、Hes-1表达在Notch1-shRNA组明显低于Nc-shRNA组,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论靶向沉默Notch1能降低肺癌干细胞增殖活性,促进其凋亡,可能与其下游基因Hes-1下调有关。

Effect of targeted silencing Notch1 on proliferation and apoptosis of human non-small cell lung cancer stem cells

Liu Hengyao;Mu Yanling;Wang Yan;Wang Fuwen;Zhao Guoli;Wang Zhaopeng;Zhou Shuping;Cai Haibo;Zhang Yueying(School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250200, China;Institute of Materia Medica, Shandong Academy of Medical Sciences, Key Laboratory for Biotech-Drugs of National Health and Family Planning Commission, Key Laboratory for Rare & Uncommon Diseases of Shandong Province, Jinan 250062, China;Laboratory of Pathology and Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250062, China;Department of Thoracic Surgery, Jining No.1 People′s Hospital, Jining 272011, China)