暗黑鳃金龟碱性磷酸酶HpALP的基因克隆、表达及其与Bt Cry8Ea3的结合特性

【目的】明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制。【方法】基于暗黑鳃金龟转录组数据，PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)基因HpALP全长cDNA序列；利用原核表达系统在体外表达HpALP，并进行Western blot检测；利用qRT-PCR测定HpALP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫不同组织(前肠、中肠、直肠、回肠、马氏管、脂肪体和体壁)中的表达水平；利用配体印记实验及ELISA技术对HpALP蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry8Ea3体外结合特性进行分析。【结果】得到了暗黑鳃金龟HpALP 全长cDNA (GenBank登录号: MZ004964)，长1 536 bp，编码512个氨基酸，预测蛋白质分子量为57.32 kD，等电点为4.70；HpALP与食粪金龟Onthophagus taurus ALP的氨基酸序列一致性最高；原核表达获得重组蛋白HpALP，经Western blot检测HpALP重组蛋白在IPTG诱导8 h时的表达量最高。qRT-PCR分析的组织表达谱结果表明，HpALP在幼虫前肠中丰度最高。HpALP重组蛋白可以与Cry8Ea3特异结合，解离常数Kd值为76.21±26.44 nmol/L，最大亲合力B_max值为0.59±0.068；而HpALP重组蛋白与对照Cry1Ab35不结合，Kd值为142.50±137.30 nmol/L，Bmax值为0.013±0.005。【结论】分离鉴定了暗黑鳃金龟HpALP蛋白，它与Bt Cry8Ea3亲和力强，推断其为Cry8Ea3的受体蛋白。研究结果为明确Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟的作用机制提供了理论依据。

Gene cloning and expression of alkaline phosphatase HpALP ofHolotrichia parallela(Coleoptera: Scarabaeidae) and its binding affinity with Bt Cry8Ea3