极耐热α-L-鼠李糖苷酶的性质及其在异槲皮素制备中的应用研究

α-L-鼠李糖苷酶可特异性切除糖苷类化合物上连接的α-L-鼠李糖基，已被广泛用于食品、医药等工业领域。作者旨在获得耐受高温的α-L-鼠李糖苷酶，提高工业生产的效率和降低使用成本。首先对嗜热菌Sulfolobus islandicus来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行克隆及大肠杆菌的异源表达，随后测定了系列酶学性质，接着优化了该酶制备异槲皮素的酶法制备工艺。结果表明：重组酶SisRha在90 ℃下酶活力最佳，具有极好的热稳定性，其在80 ℃下孵育120 min后酶活力几乎没有损失；最适反应pH为5.5，在pH 4.5~7.0时，pH稳定性良好；重组酶SisRha对人工底物对硝基苯酚鼠李糖糖苷（pNPR）的K_m值为（0.15±0.03） mmol/L，V_max值为（6.26±0.51） U/mg，kcat值为（10.48±0.86） s-1；对底物pNPR、芦丁、朝藿定C、柚皮苷、橘皮苷和淫羊藿苷的比活力分别为25.06、11.89、6.74、3.14、2.77、0.42 U/mg。重组酶SisRha转化芦丁生成异槲皮素的适宜工艺为：用酶量0.4 U/mL ，在85 ℃、pH 5.0的条件下反应1 h，可将2 mmol/L芦丁几乎全部转化，摩尔转化率高达98.56%。本研究丰富了现有的α-L-鼠李糖苷酶资源，为嗜热菌来源的α-L-鼠李糖苷酶的研究奠定了基础，同时提供了一种高温转化芦丁制备异槲皮素的方法。