可溶态和膜结合态双孢蘑菇多酚氧化酶的分离纯化及酶特性分析

为开发一种双孢蘑菇两种不同形态多酚氧化酶（polyphenol oxidase,PPO）的提取纯化方法，通过温度诱导相分配、分步硫酸铵沉淀盐析、DEAE阴离子交换层析，对双孢蘑菇中的可溶态PPO(soluble PPO,sPPO)和膜结合态PPO(membrane-bound PPO,mPPO)进行分离纯化，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳和Native-聚丙烯酰氨凝胶电泳及米氏方程对纯化后两种形态PPO的纯度、分子质量及酶促反应动力学进行探究。双孢蘑菇sPPO和mPPO经纯化后对邻苯二酚的比活力分别达到6 912.88 U/mg和19 092.94 U/mg，相比于粗酶液，酶的比活力分别提高到12.20倍和10.86倍，且纯化后mPPO的比活力显著高于sPPO。酶促反应动力学结果显示，sPPO和mPPO对不同底物的催化活性差异较大，对底物邻苯二酚的催化活性较高，且mPPO比sPPO对底物邻苯二酚的亲和力更强，酶促反应速度更高。sPPO和mPPO对邻苯二酚的最适反应温度均为30℃，最适pH值均为6.8。本研究为双孢蘑菇两种状态PPO的质谱鉴定、酶学特性以及抑制酶促褐变的发生等研...