木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株,但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖,为了改良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能,利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点,依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR。采用融合表达策略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1的融合序列,并将其插入pUG-LR载体中,构建成含遗传霉素G418抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1。以工业酿酒酵母ZU-01为宿主,通过优化后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞,30℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418浓度,得到10株生长较快的优良性状转化子。在不含G418的YEPX培养基上传代8次以上,以转化子基因组DNA为模板,进行PCR检测,均可获得目的基因片段。研究结果表明:木糖还原酶基因xyl1已定向整合于ZU-01染色体DNA上并稳定遗传,为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。