| 摘 要： | 目的优化治疗用质粒DNA十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)纯化工艺,为其规模化生产奠定基础。方法采用碱裂解法裂解含质粒pEGFP的大肠埃希菌(E.coli)DH5α菌种,在碱裂解液中加入不同终浓度的CTAB及不同终浓度的NaCl、KAc、LiCl、CaCl2、MgCl2溶液,确定CTAB纯化质粒DNA的最佳浓度,并分析盐对质粒DNA选择性释放的影响。分别采用BCA蛋白浓度测定试剂盒、内毒素检测试剂盒和Real time-PCR法检测纯化的质粒DNA中宿主蛋白含量、内毒素含量和细菌基因组DNA含量;通过A549细胞及动物转染试验检测纯化质粒DNA的体外和体内生物活性。结果 CTAB纯化质粒DNA的最佳浓度为0.004%;用NaCl、KAc或LiCl提取的质粒DNA中,RNA均未完全去除,而用CaCl2或MgCl2提取的质粒DNA中,RNA含量(RNA/nucleic acid)均小于1%,CaCl2最佳终浓度范围为0.4～0.5 mol/L,MgCl2最佳浓度范围为0.3～0.4 mol/L;使用0.4 mol/L MgCl2的CTAB法纯化的质粒pEGFP的杂蛋白质、细菌基因组DNA、内毒素和RNA含量均符合FDA对治疗用质粒DNA的要求;纯化的质粒pEGFP DNA回收率达80%以上,且体外生物活性显著高于市售试剂盒纯化的质粒(P<0.05),而体内生物活性与试剂盒纯化的质粒相当(P>0.05)。结论优化了CTAB法纯化质粒DNA的工艺,该方法操作简便,经济高效,纯化得到的质粒DNA各项指标均符合FDA质量标准,且转染基因表达效率较高,质量可靠,适用于质粒DNA的大规模纯化生产。
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