兔原始生殖细胞体外培养的研究

旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）体外分离培养的最佳条件，从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式，另将培养液分为A、B、C、D 4组，以D组为对照组，探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次，利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining，AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色；实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明，机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍，而兔PGCs经不同的消化法传代发现，酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast，REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）+2 ng·mL^-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）+4 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）+10 ng·mL^-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF））所获得的集落数量最多，具有较好的集落形态，保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示，PGCs集落呈红黑色； RT-PCR结果显示，体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示，兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代，适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法，为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。

Study on the Culture of Rabbit (Oryctolagus cuniculus) Primordial Germ Cells in Vitro