氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素(CAP)残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法。在CAP羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和包被抗原CAP-HS-OVA,用CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和ci-ELISA筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备抗CAP单克隆抗体;以CAP单克隆抗体为基础、CAP-HS-OVA为检测原建立ci-ELISA方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗CAP抗体的杂交瘤细胞株(2C4),抗体效价为4.8×10-5,利用2C4腹水优化得到ci-ELISA最佳试验条件:0.4μg/mL CAPHS-OVA 37℃包被2h;5%猪血清37℃封闭1h;1∶6.4×104 CAP单克隆抗体37℃孵育15min;1∶1 000羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)37℃孵育30min;室温显色9min。绘制的CAP残留ci-ELISA标准曲线为典型的S型,与4参数logit拟合曲线相吻合,半数抑制浓度(IC50)为0.53ng/mL。添加回收试验结果显示,阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%~96.6%和93.7%~96.8%,批内变异系数分别为2.3%~5.0%和2.2%~4.6%,批间变异系数分别为2.7%~4.1%和2.3%~3.6%。HPLC对比试验结果显示,ci-ELISA与HPLC的测定结果无显著差异。本试验成功建立了CAP的ELISA残留检测方法,该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可满足动物源性食品中CAP残留检测要求。