利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）的基因组全长序列，快速构建中国株HBV感染性克隆，建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物，扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析，确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）技术，构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2，采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组，其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒，该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制，抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆，所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制，可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。