金槐ISSR-PCR反应体系的优化和引物筛选

目的优化和建立稳定的金槐ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR-PCR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以dNTP、Tap酶、ISSR引物、Mg~(2+)浓度和模版DNA 5个影响因素进行4水平优化试验,并对反应体系进行验证;采用优化所得的最佳反应体系进行引物筛选。结果确立了金槐的最佳ISSR-PCR反应体系:即在25μl总体积反应体系中包含10×Buffer2.5μl,MgCl22.5mmol·L~(-1),ISSR引物0.6μmol·L~(-1),dNTPs0.25mmol·L~(-1),Taq酶1.0U,模板DNA约50ng。通过最佳体系进行引物筛选,获得11条适宜金槐扩增的ISSR引物。结论经过12份金槐样品的验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于金槐遗传多样性、指纹图谱和标记辅助育种等方面的研究。