人铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人铜锌超氧化物歧化酶（hCu，Zn-SOD）原核表达载体并诱导其表达，纯化及鉴定目的蛋白，为其临床应用奠定基础。方法根据已报道的hCu，Zn-SOD基因序列，采用RT-PCR技术从外周血单个核细胞（PBMC）中获得SOD cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-Teasy中，重组质粒经酶切，PCR及测序鉴定正确后，将目的片段插入原核表达载体PET20b（＋）中并转化大肠杆菌DE3，通过IPTG诱导表达出目的蛋白，经镍固定金属亲和层析纯化。采用邻苯三酚自身氧化法测定SOD生物学活性。结果序列分析表明SOD基因成熟肽编码区含有465bp与GenBank（X02317）中已报道序列一致的SOD核苷酸。经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示表达的目的蛋白分子质量约为19kD并与商品化的人SOD单抗呈特异性反应。经Ni^2＋-NTA琼脂糖纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。可溶蛋白酶活力达1300U／ml。结论在大肠杆菌中获得了人SOD的高效表达，为研究其生物学功能和广泛应用奠定了基础。