FNDC5过表达慢病毒载体的构建及稳定转染THP-1细胞系

目的：构建过表达Ⅲ型纤连蛋白结构域包含蛋白5（fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5, FNDC5）基因的慢病毒载体，获得稳定转染FNDC5的THP-1细胞系。方法：PCR扩增目的基因FNDC5，将目的基因构建入pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro慢病毒载体中，在DH5α感受态细胞中进行扩增，测序及鉴定合格后利用四质粒包装系统转染293T细胞，包装成过表达慢病毒颗粒并测定病毒滴度。Western blot检测重组慢病毒中FNDC5的表达情况后，将获得的重组慢病毒转染THP-1细胞系，荧光显微镜观察并计算其转染效率。经嘌呤霉素筛选建立FNDC5过表达的稳转细胞系后，将细胞分为3组，分别为空白组、空载组和FNDC5组，用Western blot及RT-PCR检测其FNDC5的表达情况。通过油红O染色后观察FNDC5过表达对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的影响。结果：PCR产物鉴定及测序结果显示成功构建FNDC5过表达慢病毒载体；转染293T细胞后可检测到绿色荧光，Western blot检测FNDC5-Flag标签有表达，包装后病毒的滴度为1.32×109 TU/mL；Western blot及RT-PCR检测重组慢病毒转染THP-1细胞系，与空载组对比，FNDC5组中FNDC5蛋白表达明显增加（238.0±24.9）％]，有统计学意义（P=0.000）；与空载组对比，FNDC5组中FNDC5 mRNA表达水平明显增加（228.5±3.4）％]，有统计学意义（P=0.000）。FNDC5过表达转染THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞中的脂质蓄积减少。结论：本实验成功构建了FNDC5基因的过表达慢病毒载体，通过FNDC5过表达慢病毒感染建立了FNDC5稳转的THP-1细胞系，证明FNDC5可明显减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的脂质蓄积，为后续研究奠定基础。