EvaGreen多重荧光RT-PCR结合熔解曲线分析同时检测3种呼吸道病毒

目的建立能同时检测甲型流感病毒(Flu-A)、乙型流感病毒(Flu-B)和鼻病毒(HRV)的Eva Green多重荧光RT-RCR熔解曲线分析方法。方法针对Flu-A的M基因、Flu-B的NS1基因、HRV的5’NCR设计检测引物,并使3个基因扩增产物的解链温度(T_m值)相差≥1.5℃。采用Eva Green新型荧光染料,通过优化反应条件建立一步法多重RT-PCR反应体系。通过与商品化的荧光RT-PCR试剂盒的对照试验,对新建方法进行性能验证。结果 3种病毒的PCR产物均获得特异性的熔解曲线峰,T_m值范围分别为:Flu-A,85.0~85.5℃;Flu-B,82.5~83.0℃;HRV,88.5~89.5℃,可以通过T_m值差异明显区分3种病毒。100份临床样本的性能验证显示,新方法对3种病毒的检测均有较高的灵敏度、特异性和检验效能。结论针对3种常见呼吸道病毒建立了基于Eva Green结合熔解曲线分析的多重荧光RT-PCR方法。该方法简便实用、成本低廉,为喘息性疾病的临床诊断和病原谱研究奠定了方法学基础。