缺血缺氧再灌注不同损伤程度人脐静脉内皮细胞变化与清开灵的干预效应(英文)

背景:“毒损脑络”是急性脑血管病的主要病机,以脑微血管损伤为主要表现。目的:建立不同缺氧缺血再灌注时间的细胞模型及施加药物干预,观察清开灵注射液对不同损伤程度人脐静脉内皮细胞ECV304的保护作用。设计:以培养的细胞为观察对象的随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院中西医结合科。材料:实验于2002-02/04在北京中医药大学附属东直门医院中心实验室完成。实验用人脐静脉内皮细胞ECV304随机分为7组,即正常组、缺氧6h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组、缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组。清开灵注射液主要成分为牛胆酸、猪去氧胆酸、黄芩苷、栀子总苷等。方法:缺血再灌注模型的制作:①从培养箱中取出培养的细胞,缺氧6h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h对照组分别吸除原培养液,换入无糖Earle’s液,细胞放入缺氧槽中37℃缺血缺氧培养。缺氧6h再灌注12h对照组培养6h,缺氧24h再灌注12h对照组培养24h后,分别吸去无糖Earle’s液,换入无血清1640液后置于37℃CO2培养箱中再灌注培养12h。②缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组分别在缺氧24h再灌注12h对照组造模的基础上,向各自培养液中加入质量浓度为5,10,20mg/L的清开灵对细胞进行培养。③缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组在缺氧6h再灌注12h对照组造模的基础上,向培养液中加入质量浓度为10mg/L的清开灵。④细胞存活率以四唑盐比色试验测定,乳酸脱氢酶漏出率用乳酸脱氢酶试剂盒测定,细胞凋亡率行碘化吡啶染色后用流式细胞仪检测,Cellquest软件进行分析。主要观察指标:①细胞形态学观察结果。②各组细胞存活率、乳酸脱氢酶漏出率及细胞凋亡率。结果:①细胞形态学观察:正常组细胞密集,贴壁良好,伸展充分,细胞表面光滑,有较多的分裂期细胞,细胞长满底面,呈典型的“铺路石征”;缺氧6h再灌注12h对照组及缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组细胞形态改变不明显;缺氧24h再灌注12h对照组细胞较稀疏,脱壁较多,可见大量肿胀变圆的损伤细胞及破碎细胞的碎片,贴壁细胞皱缩明显,可见伪足,分裂期细胞少;缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组细胞贴壁良好,表面光滑,未发生皱缩,可见分裂期细胞。②各组ECV304细胞存活率:与缺氧24h再灌注12h对照组比较,缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高犤(42.5±2.8),(72.9±8.0),(80.3±12.7)%,P均<0.01犦,而缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组则显著下降至(10.1±0.4)%,P<0.01。正常组为100%。③各组ECV304细胞乳酸脱氢酶漏出率:与缺氧24h再灌注12h对照组比较,缺氧24h再灌注12h低浓度清开灵组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高犤(6.6±1.4),(2.4±1.4),(2.4±0.5)%,P均<0.01犦,而缺氧24h再灌注12h高浓度清开灵组则显著升高至(16.1±2.2)%,P<0.01。正常组为(2.2±1.0)%。④各组ECV304细胞凋亡率:与缺氧6h再灌注12h对照组比较,缺氧6h再灌注12h中浓度清开灵组明显升高犤(2.2±0.5),(1.5±0.4)%,P<0.05犦;与正常组比较,缺氧24h再灌注12h对照组、缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组均显著升高犤(0.9±0.2),(5.5±2.5),(9.9±4.3)%,P均<0.01犦;并且缺氧24h再灌注12h中浓度清开灵组比与缺氧24h再灌注12h对照组升高更明显(P<0.01)。结论:①清开灵注射液对不同程度缺血再灌注损伤的ECV304细胞均有保护作用,但随着损伤程度的不同而表现为两种相反的保护形式。②对于缺血6h再灌注12h此类受损伤较轻的ECV304细胞,主要表现为降低细胞的凋亡率;而对于缺血24h再灌注12h此类缺血再灌注损伤较重的ECV304细胞,则增加细胞的凋亡率,使坏死的细胞减少。③与坏死细胞相比,凋亡细胞不发生溶酶体、线粒体及胞膜的破裂,没有内涵物的外泄,故不引起周围细胞的次级损伤,从而提高了细胞存活率,起到保护大多数细胞的作用。