禽脑脊髓炎病毒VP0基因的克隆与序列测定

禽脑脊髓炎（avian encephalomyelitis，AE）又名流行性震颤，是一种主要侵害1月龄内雏鸡的病毒性传染病。该病传染迅速，既可垂直传播又可水平传播，危害极大。世界许多国家和地区均有该病发生和流行的报道。我国学者张泽纪等于1980年首次发现广东有疑似此病，1982年李心平等通过病理学方法确认此病，随后在我国各地均发现该病的发生和流行，给养鸡业造成较大的损失。 　　禽脑脊髓炎病毒（AEV）是一种无囊膜的二十面体对称的病毒粒子，大小为26nm左右。Shafren和Tannock（1991）利用放射性碘标记电泳分析AEV的结构蛋白发现，它主要有3种结构蛋白即VP1、VP2和VP3。Marvil等（1999）测定了AEV疫苗株1?143株的全基因组序列，揭示出AEV结构蛋白有VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP2和VP4又合称VP0。我们从河北地区某艾维因肉鸡群自然发病的肉雏鸡脑组织中分离鉴定出一株AE病毒-L2Z株。根据发表的AEV序列设计引物，利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，在体外从AEV分离株感染的SPF鸡胚病变组织中扩增出VP0基因，在该片段的5′和3′端均加上KpnI位点，成功地将VP0 cDNA插入到质粒pBssK的KpnI位点之间，获得阳性克隆，并对其进行测序。结果发现，该基因长726bp，编码242个氨基酸，与AEV 1?143株VP0基因的核苷酸与氨基酸之间的同源性分别为95.2%和97.5%，而与小RNA病毒科其它病毒属如人甲肝病毒HAS-15株相应基因核苷酸和氨基酸之间的同源性分别为50.1%和50.8%，与肠道病毒属的PV-1 Sabin株的同源性分别为20.5%和16.5%，与鼻病毒属的HRV-14株的同源性分别为25.5%和17.8%，与心病毒属的EMCV PV2株的同源性分别为25.9%和19.4%，与口蹄疫病毒属FMDV-C株的同源性分别为26.3%和18.6%，与人类肠道致细胞病变孤儿病毒ECHOV的同源性分别为24.9%和16.1%。在系统发育树上，L2Z株与AEV 1?143株之间的距离最近，其次与甲肝病毒之间距离较近，而与小RNA病毒科其它病毒属之间的距离较远。 　　Marvil等（1999）首先测定出AEV 1143株的全基因序列，发现与甲肝病毒HM-175株之间氨基酸同源性为39%，与该科病毒其它病毒属之间的氨基酸同源性为19%～21%，其中VP0基因与甲肝病毒HM-175株相应基因氨基酸之间同源性达到71.8%，认为AEV与甲肝病毒属之间关系密切。Todd等（1999）对AEV VR株的3′端869bp序列测定表明，它与甲肝病毒相应区域氨基酸之间的同源性为35.7%，均高于与该科病毒其它病毒属相应氨基酸之间的同源性，也认为AEV与甲肝病毒之间最为接近。本试验发现：AEV分离株L2Z株VP0基因与甲肝病毒相应氨基酸之间的同源性为50.8%，而与该科病毒的其它属病毒相应氨基酸之间同源性仅在16.1%～21.9%之间。从系统发育树上也进一步表明，AEV L2Z株与甲肝病毒之间同源性之间距离最短，亲缘关系最近，而与肠道病毒属之间亲缘关系较远。第6次国际病毒学分类报告中将AEV划为小RNA病毒科肠道病毒属，但从我们的实验结果与Marvil等（1999）和Todd等（1999）的报道，从基因水平上证明AEV与甲肝病毒属更接近，而与肠道病毒属亲缘关系较远，因此认为AEV是否归为小RNA病毒科肠道毒属有待进一步确定。 　　本研究成功地进行了AEV分离株VP0基因的克隆与序列测定，为下一步进行AEV基因结构研究打下了基础。