PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用 |
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引用本文: | 陈芳,杨沛艳,朱久玲.PGRN和Rev-erbβ双基因敲除HEK 293细胞系的构建及应用[J].生物工程学报,2018,34(10):1679-1692. |
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作者姓名: | 陈芳 杨沛艳 朱久玲 |
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作者单位: | 安康学院现代农业与生物科技学院;陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室 |
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基金项目: | 国家自然科学基金 (No. 81471772),安康市科技局科学技术研究项目 (No. 2017AK02-17),安康学院高层次人才专项 (No. 2017AYQDZR05) 资助。 |
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摘 要: | 为研究PGRN与Rev-erbβ相互作用可能存在的分子机理及其生理意义,在前期构建的Rev-erbβ基因敲除HEK293 C3-6细胞系的基础上,利用CRISPR/Cas9技术构建PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293细胞系。首先,针对PGRN基因设计了4个不同的sgRNA,经筛选将活性较高的PGRN sgRNA 2和sgRNA 3串联,构建携带双PGRN sgRNA和Cas9的慢病毒打靶载体pLenti/CMV-Loxp-Cas9-sgRNA2-U6-sgRNA3-U6-Loxp-EF1α-Puro。再将包装的携带Cas9和双PGRN sgRNA的慢病毒感染HEK293(Rev-erbβ~(-/-))细胞,通过筛选、克隆化及测序分析获得双基因敲除的HEK293 C3-6/23(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))单克隆细胞系,并用qRT-PCR和Western blotting检测HEK293(C3-6/23)细胞中PGRN mRNA和蛋白质的表达。最后,在双基因敲除HEK293(C3-6/23)细胞系中,通过回补基因方式研究PGRN介导Rev-erbβ对靶基因启动子转录活性调控研究。在PGRN和Rev-erbβ双基因敲除的HEK293(C3-6/23)细胞系中,PGRN基因的两条DNA链均为缺失突变型,PGRN mRNA和蛋白质的表达均未达到检测水平。同时在HEK293(C3-6/23)细胞系中研究发现PGRN与Rev-erbβ相互作用,可以增强Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控。利用CRISPR/Cas9系统,成功构建了双基因敲除的HEK293(Rev-erbβ~(-/-);PGRN~(-/-))C3-6/23单克隆细胞系。利用该敲除细胞系研究发现PGRN可以影响Rev-erbβ对靶基因启动子转录的调控,但PGRN参与介导Rev-erbβ转录调控的机制还有待进一步研究。
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关 键 词: | PGRN,Rev-erbβ,CRISPR/Cas9,双基因敲除,慢病毒打靶载体 |
收稿时间: | 2018/1/19 0:00:00 |
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