α2A-肾上腺素受体重组细胞株信号转导活性

目的 α₂-肾上腺素受体(α₂-ARs)是G蛋白偶联受体超家族中成员之一，α₂-ARs在人体多种生理活动中发挥着极其重要的作用，介导低血压、镇静、催眠、镇痛、麻醉等多种重要的生理应答和药理学效应，其相关配体在医学治疗领域中具有很大潜力。本研究旨在建立以α_2A-AR亚型为作用靶点的高选择性药物筛选平台，为该类药物的活性评价提供新研究方法。方法 对大鼠脑α_2A-AR进行基因克隆和CHO真核细胞表达，获得阳性重组单克隆细胞株。（1）阳性重组CHO-K1细胞准备：取冻存阳性重组CHO-K1单克隆细胞株及转染空质粒的细胞株复苏，用筛选培养基培养并传代。（2）cAMP浓度标准工作曲线制备：配制cAMP浓度系列分别为0, 0.195, 0.78, 3.1, 12.5, 50和200 pmol·ml^-1（B0~B6），同时设非特异管（NSB）和空白对照管（N），酶联免疫法检测各管A₄₅₀值，以浓度为0的A₄₅₀值减去NSB的A₄₅₀值为B0，其余各浓度A₄₅₀值减去NSB的A₄₅₀值为B值，以B/B0(%)作为纵坐标，以标准cAMP浓度的常用对数值为横坐标，列出线性回归方程。（3）重组表达受体与激动剂结合后介导胞内cAMP信号反应检测：将培养的8个重组阳性细胞株与1个重组阴性细胞株按5×10⁸ L^-1分别接种至96孔板，每孔100 μl，37℃5％CO₂培养过夜；每孔加入肾上腺素8 μmol·L^-1作为激动剂，37℃5％CO₂培养30 min；去掉细胞培养液并用生理盐水洗涤，加入盐酸0.1 mol·L^-1作为细胞溶解液，室温下振摇10~20 min以使细胞充分溶解，将细胞溶解样品转入96孔酶联检测板，进行酶联免疫检测胞内cAMP的含量变化情况。结果 （1）阳性重组CHO-K1细胞复苏后，在筛选培养基中生长状况良好，表明α_2A-AR在CHO-K1细胞中稳定表达。（2）cAMP浓度测定标准工作曲线制备：以标准cAMP浓度的常用对数值为横坐标，以B/B0(%)作为纵坐标作图得到一条近似直线，线性回归方程为B/B0(%)＝-27.6 lg［cAMP］＋89.8，r＝-0.9776，P<0.01。（3）重组表达受体与激动剂结合后介导胞内cAMP信号反应检测：8个重组阳性细胞株与1个重组阴性细胞株，在激动剂处理前后，细胞内A₄₅₀变化情况为：重组阴性细胞株cAMP水平无明显变化；8个重组阳性细胞株cAMP水平变化并不一致，其中，5株重组阳性细胞株cAMP水平未见明显变化；2株重组阳性细胞株cAMP水平下调，加入肾上腺素激动剂后的cAMP含量分别为加入肾上腺素激动剂前的74.7％, 59.6%；1株重组阳性细胞株cAMP水平明显下调，加入肾上腺素激动剂后的cAMP含量为加入肾上腺素激动剂前的1.47%。结论 8个α_2A-AR受体重组阳性细胞株对肾上腺素激动剂的信号转导反应存在有较大差异。野生型CHO细胞本身不表达α_2A-AR受体，人为导入α_2A-AR受体基因，重组受体的信号转导活性存在差异，可能是由诸多不确定因素造成的，诸如：细胞自身的活性状态及质粒进入细胞后的整合状态差异；α_2A-AR在不同细胞株的表达水平差异；α_2A-AR受体表达过程中的修饰加工差异以及真核细胞其他相对复杂的表达调控环节差异等。