小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定 |
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引用本文: | 夏迪,钱倩,刘志成,谭鸣鸣,丁媛,苏欣,孙文逵,施毅.小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定[J].医学研究生学报,2015(4):341-345. |
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作者姓名: | 夏迪 钱倩 刘志成 谭鸣鸣 丁媛 苏欣 孙文逵 施毅 |
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作者单位: | 南京大学医学院附属金陵医院(南京军区南京总医院)呼吸与危重症医学科;南京市胸科医院呼吸科;南方医科大学临床医学院 |
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基金项目: | 国家自然科学基金(81270064,81200063);南京市医学科技发展项目(YKK13089) |
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摘 要: | 目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。
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关 键 词: | 树突状细胞相关C型凝集素-1 CLEC7A基因 腺病毒载体 模式识别受体 |
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