蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)miRNA荧光定量体系的优化

实时荧光定量PCR是目前验证基因表达量的首选方法之一,现也广泛应用于miRNA的表达量研究中,但在蝴蝶兰中尚未见报道。在实时荧光定量PCR检测miRNA体系中,cDNA模板浓度以及miRNA扩增引物长短和二级结构造成的退火温度的差异会直接影响PCR扩增效率,从而降低实验结果的可信度。针对该问题,本研究首次以蝴蝶兰miR858在花萼色斑与非色斑的差异表达为实例,通过对cDNA模板浓度以及退火温度的筛选,成功地优化了蝴蝶兰miRNA荧光定量体系。结果表明:蝴蝶兰miRNA858在退火温度65℃,与2μg RNA对应的模板cDNA进行10倍稀释后扩增结果最优。本研究为蝴蝶兰miRNA荧光定量PCR标准体系的构建提供了实验依据。