转基因番木瓜pUC57-Papaya质粒标准分子的构建与适用性研究

构建了含番木瓜2个内标准基因、4个筛选靶标及3个转化体特异性片段的质粒分子pUC57-Papaya,进行了适用性验证实验。应用普通PCR和实时荧光定量PCR对其进行互换性评估；使用质粒分子对2个样品进行转基因含量测定。结果显示：质粒分子全部9个目的片段按照设计排列，序列完全一致；全部9个基因片段普通PCR和实时荧光PCR方法均能正确扩增得到预期结果，特异性、灵敏度与基因组DNA一致；全部9个基因构建标准曲线做定量测试时，与基因组DNA标准曲线斜率无显著差异，线性相关系数均大于0.99,其中内标准基因Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段的截距无差异；利用质粒分子测量2个样品的Papain、NOS终止子、YK1601与55-1事件特异性片段拷贝数，计算转基因含量，结果与基因组DNA一致；测序结果显示各片段拷贝数比值为1,质粒DNA拷贝数浓度为(2.54±0.10)×10⁶ copies/μL。构建的标准质粒分子可代替基因组DNA用于定量检测，也可作为转基因番木瓜定性和定量检测用标准物质。