用CTAB-PVP法提取棉花各组织总RNA的研究

针对棉花组织总RNA难以提取、不同组织的提取方法难以统一的问题，借鉴Jaakola等的越橘果实总RNA提取方法（即CTAB-PVP法），对棉花组织总RNA的提取效果进行了分析。实验结果表明：得到的棉花纤维、胚珠、叶片、胚根、花瓣、下胚轴和花药各组织的RNA完整性好，其D260／D280比值为1．7～2．0，产率30～180pg／g（鲜质量）；用开花后15d纤维的RNA为材料进行反转录，再利用RT-PCR和3’RACE技术进行克隆，各获得1个大小为542和712bp的cDNA克隆，经序列分析鉴定，这2个片段分别编码棉花微管结合蛋白和微丝结合蛋白。     

棉花纤维RNA提取方法的比较及酵母双杂交文库的构建

为了从棉花纤维中提取高质量的RNA用于构建酵母双杂交文库,采用4种不同的方法提取9天和19天棉花纤维的RNA。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测结果表明：热硼酸法适用于初生幼嫩纤维和次生加厚纤维的RNA提取,CTAB-PVP法仅适用于初生幼嫩纤维的RNA提取,异硫氰酸胍法和高盐高pH值法提取的RNA由于杂质含量较多而影响反转录效果。采用热硼酸法大量提取总RNA,纯化后的mRNA反转录为cDNA,通过重组将扩增的cDNA片段定向插入到pGADT7-Rec AD克隆载体中,得到棉纤维9天和19天的酵母双杂交cDNA文库。2个文库的滴度分别是1.01×107 cfu /mL和8×106 cfu /mL,cDNA插入片段长度集中分布在250~2500 bp之间。由此可以看出,构建的2个棉纤维文库质量较高,可用于棉花纤维素合成和调控途径的研究。