有机溶剂对缢蛏碱性磷酸酯酶分子构象和催化活力的影响

本文初步研究了三种有机溶剂甲醇、二甲基甲酰胺、二氧六环对缢蛏碱性磷酸酯酶(ALP)分子构象和催化活力的影响。发现在有机溶剂作用下,ALP的荧光发射光谱、紫外差光谱、园二色光谱都发生了显著的变化,而酶经甲醇、二甲基甲酰胺预处理后酶活力提高,经二氧六环预处理后活力下降,但当测活体系中有三种有机溶剂存在时,酶的活力却被大大抑制。     

有机磷水解酶纳米胶囊的调控及其对酶活性和稳定性的影响

纳米胶囊化是提高有机磷水解酶（organic phosphorus hydrolase,OPH）稳定性,进而实现其实用化的最具前景的解决方案。纳米胶囊一方面能够有效保护有机磷水解酶免于失活,但另一方面胶囊的存在也会阻碍底物与酶活性中心的接近。因此,通过调节纳米胶囊的结构来调控有机磷水解酶纳米胶囊活性和稳定性是十分值得研究的课题。本文用N-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸酯（N-succinimidyl acrylate,NAS）将有机磷水解酶表面丙烯酰化,以丙烯酰胺（acrylamide,AAM）和N-（3-氨丙基）甲基丙烯酰胺盐酸盐（N-(3-aminopropyl) methacrylamide hydrochloride,APM）为单体,在有机磷水解酶蛋白表面进行原位自由基聚合反应,制备了单分散的有机磷水解酶纳米胶囊（OPH nanocapsule,nOPH）。用透射电镜和傅里叶红外光谱对nOPH结构进行了表征。研究了不同NAS投料量在37℃下对有机磷水解酶纳米胶囊活性,及其热稳定性和有机溶剂稳定性的影响规律。当NAS投料量在75∶1以下时,纳米胶囊的存在对有机磷水解酶活性未见影响,而当大于这一投料比时,酶活性会因胶囊致密程度的上升而下降。在加热下或有机溶剂中,有机磷水解酶纳米胶囊的酶活性呈现出随着NAS投料比的增加先增加而后下降的趋势。以上结果表明,酶活性可以通过在由有机磷水解酶制得有机磷水解酶纳米胶囊的过程中,调节纳米胶囊至合适的致密程度来最大程度的保留。合适的致密程度还能显著提高有机磷水解酶纳米胶囊热稳定性和有机溶剂稳定性。这对进一步实现有机磷水解酶的实用化具有重要意义。     

arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性

【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。     

有机溶剂对HPLC测定头孢菌素C含量的影响

考察了10种水溶性有机溶剂对HPLC测定头孢菌素C含量的影响,采用C_(18)色谱柱,流动相为磷酸二氢钠-甲醇(90:10),波长254 nm。发现不同的有机溶剂有不同程度的影响,其中乙醇的影响最大;乙醇浓度越高,峰面积就越小。将含有乙醇的头孢菌素C溶液稀释到一定程度,能够有效消除乙醇的影响。稀释法具有较好的精密度、重复性和回收率,为在工业生产中准确测定头孢菌素C的含量提供了依据。     

来源于铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)所产蛋白酶PT121克隆表达及其在小肽合成上的应用

【目的】基于前期筛选到的P.aeruginosa PT121所产有机溶剂耐受性蛋白酶,本研究对该蛋白酶进行克隆表达,研究了重组蛋白的酶学性质及小肽合成上的应用。【方法】参考文献中报道的相似蛋白酶pseudolysin设计引物从菌株PT121基因组中克隆到耐有机溶剂蛋白酶PT121基因las B。构建诱导表达重组质粒p ET22b-las B,于大肠杆菌中进行表达。考察蛋白酶PT121酶学性质及小肽合成上的应用。【结果】序列分析表明las B基因编码信号肽、前肽及成熟肽3个部分,成熟肽部分含有301个氨基酸,分子量约33 k Da,属于金属蛋白酶M4家族。通过破碎条件优化,一步法制备得到较为纯净的重组蛋白酶PT121,其比活力达7700 U/mg,该酶呈现了较高的热稳定性,p H稳定性及溶剂耐受性,与野生菌P.aeruginosa PT121所产蛋白酶性质一致。在50%DMSO体系中高效催化合成了多种小肽,其中阿斯巴甜前体(Cbz-Asp-Phe-NH2)产率高达91%。【结论】蛋白酶PT121基因在大肠杆菌中克隆表达为进一步研究相关催化机理及分子改造奠定了基础。     

极性非质子溶剂中酸强度对纤维素降解制备脱水糖的影响

在极性非质子溶剂中,酸催化剂对于纤维素降解制备脱水糖的反应起到重要作用.本文考察不同强度酸催化剂在极性非质子溶剂1,4-二氧六环中对纤维二糖、纤维素降解制备左旋葡聚糖(levoglucosan,LGA)以及LGA脱水制备左旋葡萄糖酮(levoglucosenone,LGO)的影响.结果 表明:酸性过强(pKa＜-3)或...     

酶法产品推动原料药技术市场快进

近日,中化帝斯曼公司宣布,在华第3只酶法产品头孢克洛正式上市,这意味着酶法技术在国内推广应用再进一步,也凸显其对酶法产品在中国市场的潜力寄予厚望。依据中化帝斯曼提供的数据,酶法产品相对于化学合成在特殊化学原料、有机溶剂和COD排放等领域,以及原料产品本身的稳定性、纯度、色泽和气味等方面同样优势明显。中化帝斯曼有关负责人表示,酶法产品符合中国原料药产业升级和污染控制的需求,也符合中国     

S/D法灭活血液制剂中脂包膜病毒效果验证的研究

选用不同核酸的脂包膜病毒,其中RNA病毒为水疱性口炎病毒(VSV),DNA病毒为伪狂犬病毒(PRV),将两种指示病毒分别用于验证S/D法处理对纤维蛋白原、凝血酶原复合物、凝血因子Ⅷ、静注丙种球蛋白、免疫血浆等血液制剂的病毒灭活效果。结果该法对所有被处理的血液制剂中的PRV及VSV灭活能力分别为≥3.38~5.88和≥3.50~4.75logTCID50/0.1ml,表明S/D法对两种病毒核酸类型的脂包膜病毒有良好的灭活效果。     

溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1的发酵优化

溶剂稳定性蛋白酶产生菌Bacillus licheniformis YP1分离自油田土样。考察了碳源、氮源、金属离子等营养因素对YP1菌株发酵产溶剂稳定性蛋白酶的影响。YP1菌株发酵产胞外蛋白酶的最佳碳源为淀粉,果糖、甘露糖和乳糖显著抑制产酶;最佳氮源为酵母膏,干酪素、酵母粉和牛肉膏促进产酶,玉米浆和尿素显著抑制产酶。Mn^2＋可以显著促进酶活,Mg^2＋可以促进产酶,在初步优化的培养条件下,YP1菌株的胞外蛋白酶产量达980U。     

烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌YP1产胞外蛋白酶的影响

考察了添加5%(V/V)浓度的正庚烷、正辛烷、正癸烷、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃溶剂对耐有机溶剂极端微生物地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)YP1的生长及产胞外蛋白酶的影响.结果表明5%(V/V)浓度的各种烷烃溶剂对YP1蛋白酶的稳定性及菌体生物量均无显著影响,正庚烷、正辛烷、正癸烷等溶剂显著抑制YP1产蛋白酶,而十二烷、十四烷,十六烷能提高YP1产蛋白酶1倍以上.发酵液中十四烷的浓度(1%-8%,VIV)与蛋白酶的活力呈正相关性,添加十四烷后发酵过程中蛋白酶活力的显著增加出现在菌体生长的对数后期.培养过程中添加十四烷能导致YP1菌体形态显著变小.首次报道了烷烃溶剂对极端微生物产蛋白酶的影响.