水稻白叶枯病菌受寄主诱导基因的鉴定

用一个具链霉素（Ｓｍ）抗性并含无启动子ＣＡＴ基因的广宿主启动子探针质粒ＰＩＪ３１００，用鸟枪法在ＣＡＴ基因上游的ＢａｍＨ１克隆位，或插入水稻白叶枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｏｒｙｚａｅｐｖ．ｏｒｙｚａｅ），用ＢａｍＨ１完全酶切的染色体ＤＮＡ片段，将重组质粒转化大肠杆菌ＥＤ８７６７在含链霉素的ＬＢ单板上筛选转化子。得到容量为６０００个转化子的克隆群体，其中２％的克隆含有水稻白叶枯病菌启动子活性片段，在平板上表现氯霉素（Ｃｍ）抗性。在帮助质粒ＰＲＫ２０１３的帮助下，通过三亲支配，将含有水稻白叶枯病菌启动子片段的重组质粒转移进野生型的水稻白叶枯病菌中去，在含链霉素的ＰＳＡ平板上筛选１６００个接合子，其中一个在平板上表现氯霉素抗性及含有组成表达的水稻白叶枯病菌启动子。随机选取２００个平板上对氯霉素敏感的接合子，接种用氯霉素处理的水稻感病品种金南风，得到１５个比对照明显致病的克隆。用其中一个含受水稻特异诱导启动子的重组质粒为探针，在水稻白叶枯病菌野生菌基因文库中筛选到２７个阳性克隆。     

利用计算生物学方法识别原核启动子的研究进展

原核启动子作为DNA中的一个关键区域,含有RNA聚合酶特异性结合和基因转录起始所需的保守序列,在转录调控中发挥着重要作用。然而,由于实验方法在实验周期和实验耗材上的限制,对启动子序列进行批量准确的鉴定仍然是分子生物学领域一项艰巨的任务。随着计算机技术的发展,出现了多个基于计算生物学的原核启动子预测方法,这些方法在数据质量、数据集大小、提取的特征、特征选择技术、分类算法以及评估策略方面表现出高度的多样性。该文系统地比较并总结这些方法,以便改进和进一步发展原核启动子识别技术。     

大肠杆菌启动子启动强度的预测

启动子是DNA序列中的关键元件,直接影响生物的转录与表达,启动子的研究对转录机制的阐明以及整个基因组功能的注释都具有重要作用。然而,用实验方法对启动子进行检测费时费力,发展启动子预测的方法具有十分重要的意义。本文基于离散小波变换建立伪三碱基组成表征DNA序列,支持向量机建模,预测大肠杆菌启动子的启动强度。首先采用二维映射法对DNA序列进行映射,得到二维离散的数字序列,并将之合并为一维数字序列;采用离散小波变换对数字映射序列进行转换,将得到的小波变换结果与三碱基组成结合构建伪三碱基组成,离散小波变换中小波函数与小波分解尺度的优化通过5-折交叉验证选取;构建得到的伪三碱基组成作为支持向量机的输入参数,建模进行预测。训练集得到的预测相关系数R为0.9830,RMSE为0.0907;测试集得到的预测相关系数R为0.8606,RMSE为0.1014。结果表明,模型的预测效果良好,说明基于离散小波变换的伪三碱基组成能够有效地反映DNA序列中碱基的顺序信息,本文方法不仅能够有效地实现大肠杆菌启动子启动强度的预测,也为DNA其他生物功能的预测提供了参考。     

约氏疟原虫Pys25和Pys48抗原的表达与产物活性初步研究

通过家蚕杆状病毒表面展示技术获得约氏疟原虫有性阶段候选抗原Pys25(217AA)和Pys48(455AA),以期建立一种新的鼠疟模型。首先利用大肠杆菌原核表达系统表达这两种抗原,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,同时利用家蚕杆状病毒表面展示技术,并改造pFastBac Dual载体,在其Ph启动子前端加入哺乳动物启动子CMV,并将目的蛋白基因与杆状病毒囊膜蛋白gp64基因片段融合表达,融合蛋白展示在病毒粒子表面。用其免疫Balb/c小鼠,在小鼠体内,CMV启动子启动融合蛋白表达,共同刺激小鼠产生多克隆抗体。通过间接ELISA检测,两种抗原抗体效价均能达到1∶12 800。本实验为后期免疫阻断效应研究、多时期多价疫苗的构建及鼠疫模型的建立提供了实验基础。     

启动子序列的非均衡检测识别算法研究

通过改进Hessian矩阵对角参数,调整支持向量机中超平面的位移,将数据量少的样本从两类非均衡样本中进行分离,结合隐马尔可夫随机迭代,实验发现,不能简单固定Hessian矩阵的对角参数,而必须加之以可调整的权系数才能控制错分的样本数.对启动子序列进行识别,平均识别率达到92.8%。     

启动子序列的非均衡检测识别算法

通过改进Hessian矩阵对角参数,调整支持向量机中超平面的位移,将数据量少的样本从两类非均衡样本中进行分离,结合隐马尔可夫随机迭代,实验发现,不能简单固定Hessian矩阵的对角参数,而必须加之以可调整的权系数才能控制错分的样本数.对启动子序列进行识别,平均识别率达到92.8%.     

粗糙集理论在启动子识别中的应用研究

针对目前基于计算机的启动子识别技术的研究现状,指出现有启动子识别技术的不足,并探讨将粗糙集理论应用于启动子识别研究可能的改进方向.     

紫杉醇对Caski细胞增殖及APC、DKK-3基因表达的影响

目的研究紫杉醇对Caski细胞增殖及APC、DKK-3基因表达的影响。方法用MTT法、RT-PCR法及甲基化特异性PCR分别检测紫杉醇对人宫颈癌Caski细胞株增殖的影响、APC与DKK-3 mRNA表达水平、APC与DKK-3启动子甲基化水平。结果≥1μmol/L紫杉醇能明显抑制人宫颈癌Caski细胞株的增殖(P<0.05);从5μmol/L开始,随着紫杉醇给药剂量的增大,Caski细胞APC、DKK-3 mRNA表达水平明显增加(P<0.05),而Caski细胞APC、DKK-3启动子甲基化水平显著降低(P<0.05)。结论紫杉醇能呈剂量依赖性的抑制Caski细胞的增殖并上调APC、DKK-3 mRNA的表达,这可能与其诱导APC、DKK-3启动子的去甲基化有关。     

重组大肠杆菌1,2,4-丁三醇合成途径的平衡优化

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butantriol,BT）属于非天然化学品,是军工材料1,2,4-丁三醇三硝酸酯的前体。在重组大肠杆菌中,木糖经脱氢、脱水、脱羧和还原合成BT。但途径各反应不平衡使得中间代谢物积累限制菌体生长和产物合成。本研究首先通过CRISPR/Cas9敲除基因yjhG和yqhD构建无本底表达宿主菌,随后利用不同启动子组合调节BT合成途径中基因xdh、yjhG和yqhD的表达。结果发现,以P _inv 表达醇脱氢酶基因yqhD使BT产量达到14.4g/L;以P _tac 表达脱氢酶基因xdh和P _{rrnH P1}表达脱水酶基因yjhG的组合方式,BT产量达到15.6g/L,比对照菌株KXW3009分别增加5.9%和14.7%。本研究通过对中间代谢物木糖酸合成和代谢的组合优化,促进了BT的合成,为后续研究提供了借鉴。     

STGC3基因启动子生物信息学分析及载体构建

目的运用生物信息学预测并分析鼻咽癌抑癌基因STGC3启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体。方法采用生物信息学软件预测STGC3基因5'端上游调控区5 000 bp序列进行启动子预测与分析,克隆最有可能的启动子,构建萤火虫荧光素酶双报告基因重组质粒,重组质粒经MluⅠ和BglⅡ限制性内切酶酶切及测序鉴定。结果 STGC3基因5'端上游-3 046 bp至-46 bp区域内有启动子活性,在-2 992 bp至-69 bp间启动子分值达0.8以上,其中-845 bp至-795 bp间分值最高,达到1.0。在-1 140 bp和-774 bp处检测到GC盒信号;在-441 bp处检测到CAAT盒信号。在-1 805 bp至-1 705 bp和-900 bp至-684 bp间各有一个Cp G岛;在-2 348 bp和-948 bp处各有一个转录起始位点。经不同长度的片段缺失比对,取最有可能的283 bp(-1 360 bp至-1 077 bp)、281 bp(-934 bp至-653 bp)和571 bp(-500 bp至+72 bp)启动子片段构建p GL3-en283、p GL3-en281及p GL3-en571三种质粒,质粒经酶切测序,酶切片段大小一致,序列正确。结论根据生物物信息学分析结果,成功构建STGC3基因启动子萤火虫荧光素酶报告基因表达载体,为双荧光素酶报告基因检测系统研究该基因启动子活性提供前期基础。