荧光RT—PCR快速检测禽流感病毒H5亚型的研究

本研究根据禽流感病毒H5亚型的RNA4节段，设计、合成多对引物、探针，并通过筛选获得灵敏度、特异性好的组合，在此基础上对荧光RT-PCR反应体系中的各组分进行优化，并建立对各种禽类样品中病毒核酸的提取方法。通过对阳性鸡胚尿囊液及人工攻毒的SPF鸡、肉鸡、肉鸭的各脏器进行检测，并与传统鸡胚病毒分离进行对比，显示该方法与传统鸡胚病毒分离灵敏度接近，但检测时间由原来的21天缩短为4小时。     

原料血浆混样HCV/HIV-1核酸检测的方法学研究

目的　建立原料血浆混浆核酸检测方法。方法　以国产HCV和HIV核酸扩增 (PCR)荧光定量检测试剂进行WHO标准品的灵敏度、重现性和精密度实验 ,并对 19196份国内原料血浆进行HCVRNA和HIV 1RNA核酸扩增分析。结果　扩增系统能够确保高拷贝数 (2 0 0IU/ml)标准品核酸的检出率 ,对于 <10 0IU/ml的低拷贝数标准品核酸检出率逐渐降低 ;受检原料血浆样本没有检出HCVRNA和HIV 1RNA阳性。结论　核酸扩增方法适用于原料血浆病毒筛查。     

含内标的荧光PCR—荧光定量PCR

1.前言 PCR技术应用于体外基因检测是临床诊断学上的一项重大突破,但由于传统的PCR检测易污染、假阳性率高等原因,被国家明令禁止使用于临床检验。为了克服传统PCR的上述缺点,发挥它早期、快速诊断的优点,近年来,发展了多种将传统PCR技术与其它技术结合起来的新型PCR技术,最成功的有PCR与ELISA结合的PCR-ELISA技术和PCR与荧光检测结合的荧光PCR技     

液态芯片的高敏感性检测HIV-1 RNA

目的建立高敏感的液态芯片检测血液HIV-1 RNA的方法。方法抽提NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）确定HIV-1 RNA载量的患者血浆RNA，对HIV-1引物进行生物素标记，行一步法RT-PCR扩增靶HIV-1 gag区片段。PCR产物与两个交联HIV-1特异探针的微球杂交，同时对于HIV-1病毒载量在100-790拷贝/ml样本进行荧光定量PCR检测。结果对NASBA确定阳性的上海108例（载量170-3 300 000）、COBAS定量的北京86例阳性（载量477-2 040 000）以及5例NIH的HIV标准品（〈100；273；1 610；11 300；33 800）的结果进行液态芯片多区段检测HIV-1 RNA，总阳性率为96.98%（193/199），液态芯片检测的敏感性与NASBA、COBAS方法相当（P〉0.05），对于HIV-1 RNA载量在180-790拷贝/ml的13个样本的荧光定量PCR未检测到信号，液态芯片检测结果为阳性。结论多区段液态芯片法检测HIV-1 RNA灵敏度高、特异性强、重复性好，降低漏检率，而且具有操作简便、快速、低成本的特点，将液态芯片技术应用于血液筛查将有助于提高HIV-1阳性血液的检出率和输血的安全性。     

液态芯片技术检测Y 染色体微缺失方法的优化

目的优化基于液态芯片检测高通量、快检测Y染色体微缺失的方法。方法以sY84、sY86（AZFa）,sY127、sY134（AZFb）,sY152、sY153（AZFd）,sY242、sY254、sY255（AZFc）等9个Y染色体微缺失的STS位点作为检测区域,以sY14（SRY,男性性别决定基因）位点作内部对照。优化探针引物组合,建立基于液态芯片的多重PCR-技术检测Y染色体微缺失的方法。结果优化的引物对在多重PCR体系中显示特异的扩增效率;多重PCR产物与STS特异的探针微球杂交后,在Luminex上显示非常强的特异性的荧光信号。结论多重PCR-液态芯片技术检测Y染色体微缺失的方法具有高灵敏性、高特异性,高准确性,操作简单,结果可靠,使快速、高通量筛选男性不育症的分子缺陷成为可能。     

膜反向点杂交技术在HIV-1耐药性点突变检测中的应用

目的以HIV基因组pol区序列为靶基因设计可鉴别HIV耐药性突变的寡核甘酸探针对，应用膜反向点杂交技术检测HIV-1耐药性点突变。方法以临床提取HIV-1患者血清为模板，扩增产物与点在尼龙膜上的5对特异的寡核苷酸探针杂交。通过标记在PCR上游引物5’端的荧光素显色得到结果，并将其与测序结果进行对比。结果采用反向点杂交共检测了9例野生型和21例突变耐药型样本，检测结果与测序结果符合率为74％。5对探针对于野生型和突变型的扩增产物均有较好的区分性，敏感性高且信号强弱与相应产物在样本所占比例相关。结论应用膜反向点杂交技术检测HIV耐药性点突变敏感、简便、快速，具有较高应用价值。     

实时荧光PCR技术在快速检测植物及其加工产品中转基因成份中的应用

本报道了利用实时荧光PCR技术对若干植物及其加工产品中的转基因成分进行检测、鉴定的结果。首先用一套转基因植物荧光PCR定性试剂盒对这些样品中可能存在的7个目标基因(35S、nog、nptⅡ、pat、bar、FMT、cry3A)进行筛查。对15份已知的样品的检测结果与样品的标准记录完全吻合；在113份未知样品中，检出21份阳性样品。井对其中的5份阳性大豆样品和3份玉米阳性样品进一步进行定量分析，确定了这些样品中转基因成分(GMO)的含量。本同时讨论了实时荧光PCR技术在快速检测植物及其加工产品中转基因成份中的应用，认为荧光PCR技术是适合植物转基因检测、鉴定的一种快速、灵敏、准确的方法。     

CD4+CD25 nt/hi CD127lo调节性T细胞对HIV感染者免疫状态及病程进展的影响

目的:探讨具有CD4 CD25nt/hi CD127lo特征的调节性T细胞频率对中国HIV-1感染者免疫状态及病程进展的影响.方法:选取100名未经治疗的HIV-1感染者和4个年龄组的312名健康人对照,采集静脉血,经三重免疫荧光染色,用流式细胞术分析CD4 CD25 Treg表型和CD4 CD25nt/hiCD127loTreg频率并进行CD4 T细胞绝对计数;应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)在单细胞水平观察受试者的HIV-1特异性细胞免疫功能;平行检测HIV感染者的病毒载量(NASBA方法).结果:不同病程的HIV-1感染者外周血中CD4 CD25nt/hiCD127loTreg频率存在差异,进展期高于新近感染者(P＜0.001),其平均水平显著高于健康人(P＜0.001);CD4 CD25nt/hiCD127loTreg频率与HIV感染者CD4 T细胞数量呈显著负相关(r=0.354,P＜0.01),与病毒载量呈明显正相关(r=0.287,P＜0.01);高频率CD4 CD25nt/hiCD127loTreg HIV-1感染者(进展期)的外周血PBMCs经HIV-1多肽刺激后分泌IFN-γ的CD8 T细胞频率明显低于无症状的新近感染者.结论:初步证实HIV-1感染者外周血中CD4 CD25nt/hiCD127kloTreg细胞频率增加与CD4 T细胞数量降低及病程进展相关;高频率CD4 CD25nt/hiCD127lo Treg细胞对HIV-1感染者的细胞免疫功能具有抑制作用.本结果为进一步阐明HIV持续感染的免疫机制提供了新依据.     

几种中药提取物和药物对乙醇脱氢酶活性影响的研究

目的：探讨了六种中药水提取物和醇提取物及几种药物对乙醇脱氢酶活性的影响，为中药解酒保肝药物的开发提供酶学依据。方法：选择古方中常用的几味解酒保肝中药及临床常用的药物，应用瓦勒一霍赫（Valle＆Hoch）法体外测定这些药物对乙醇脱氢酶活性的影响。结果：白豆蔻和葛花的水提物、葛花醇提物、市售解酒保肝茶、九宝、葛花王、L-半胱氨酸，三七皂甙等对乙醇脱氢酶有激活作用，激活率分别为2．8％、16．0％、3．3％、40．1％、16．0％、14．3％、30．5％、10．1％。而葛根、三七、甘草、枳棋子、芦荟的水提物和醇提物、白豆蔻醇提物、盐酸雷尼替丁对乙醇脱氢酶的活性有抑制作用。结论：其中，有些药物可以通过提高乙醇脱氢酶活性来降低乙醇浓度，这可能是解酒药的作用机制之一。而其它药物的解酒机制不能单纯从酶学方面解释。