雨课堂在分子生物学检验教学中的应用

雨课堂是清华大学开发的一款线上线下混合式教学工具，适用于较抽象复杂的课程。分子生物学检验教学中引入雨课堂教学软件，发现雨课堂教学既可照顾普通学生的一般要求，又适应学生的个性化学习需求，是一款值得尝试的教学工具。     

轻链λ对RF和抗CCP抗体阴性的类风湿关节炎的临床价值研究

为了评价类风湿因子(RF)和抗CCP抗体阴性的关节炎患者就诊时血清轻链λ水平对类风湿关节炎(RA)的诊断价值,回顾性分析我院住院RA患者的临床资料,获取患者初诊的RF、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体、免疫球蛋白(Ig)和轻链等数据。根据RF和抗CCP抗体水平,RA患者分为自身抗体阴性组和阳性组。将血清阴性RA患者作为实验组,与非RA关节炎患者构成的对照组进行比较,用受试者工作特征曲线(ROC)和多元Logistic回归分析轻链λ对RA患者诊断的临床价值。结果显示,实验组较对照组关节炎患者的轻链λ水平升高,差异具有统计学意义(P=0.026);ROC分析表明轻链λ对关节炎患者发展为RA具有预测价值,曲线下面积(AUC)达到0.665[95%CI(0.518,0.812)];以620.5mg/dl为临界值,预测RA的敏感性为0.565(0.345,0.768),特异性为0.804(0.661,0.906);多元Logistic回归校正后轻链λ仍然与关节炎患者发生RA相关(OR=3.551,P=0.037)。研究结果表明,血清轻链λ水平对关节炎患者发展为RA具有一定的预测价值。     

实时荧光定量PCR检测RAGE mRNA方法的建立及初步应用

目的 建立实时荧光定量PCR(RTFQ-PCR)检测人晚期糖基化终末产物受体(RAGE)mRNA的方法并研究其在食管癌组织中的表达.方法 根据Genebank提供的序列在RAGE基因外显子5和6之间设计引物,应用SYBR Green Ⅰ荧光染料,建立检测RAGE mRNA的RTFQ-PCR方法,并对其线性、特异性、灵敏度及重复性进行评价;根据标准曲线计算出食管癌及配对远端正常组织中RAGE mRNA含量,并以RAGE mRNA和18S rRNA含量的比值作为评价RAGE mRNA表达水平指标.结果 线性范围为5.0×103～5.0×109copies/ml,相关系数为-0.98,批内变异系数(CV)为0.63%～8.71%,批间CV为1.52%～12.38%.食管癌及配对远端正常组织RAGE mRNA与18S rRNA浓度的对数比值(-x±s)分别为0.638±0.068和0.334±0.329(P＜0.005),提示食管癌组织RAGE表达上调.结论 RTFQ-PCR检测RAGE mRNA的方法具有灵敏、特异、重复性好等优点,RAGE mRNA表达水平与食管癌存在一定相关性.     

两种方法测定血清白蛋白的临床应用评价

目的分析电泳法和溴甲酚绿法检测白蛋白及白蛋白/球蛋白比值的相关性。方法本院健康体检人员及相关疾病人员102例,采用Helena全自动电泳仪和日立7600-020全自动生化分析仪分别进行测定,得出总蛋白、白蛋白及A/G比值,对上述结果进行相关性分析。结果溴甲酚绿法与电泳法进行比较:健康组ALB及A/G相关系数r分别为0.98、0.97,(P>0.05);肝病组ALB及A/G相关系数r分别为0.90、0.91(P>0.05);肾病组ALB及A/G相关系数r分别为0.74、0.73(P<0.05);多发性骨髓瘤组ALB及A/G相关系数r分别为0.52、0.55(P<0.05)。结论对健康人和肝病患者两种方法检测白蛋白有相关性,电泳法依据物理性质分离蛋白质,结果更具客观性,在肾病和多发性骨髓瘤病人的测定结果更加稳定可靠。     

免疫比浊法检测血清游离轻链的方法学评价

目的对Beckman Immage 800全自动特种蛋白分析仪检测血清游离κ、λ轻链(sFLC)进行方法学评价。方法通过Beckman Immage 800定量测定sFLC,探讨其精密度、正确度、分析测量范围、干扰和携带污染率,同时对其参考区间进行验证。结果κFLC低、高值批内精密度的变异系数(CV)分别为7.84%、2.95%,批间精密度的CV分别为7.38%、5.57%;λFLC低、高值批内精密度(CV)分别为4.59%、3.94%,批间精密度CV分别为3.97%、2.01%;测定κFLC、λFLC定值质控血清与靶值的偏倚小于5%;κFLC、λFLC分析测量范围分别为10.8~128.0 mg/L、10.1~121.0 mg/L时,a值在0.95~1.05,r2≥0.98;κFLC、λFLC携带污染率分别为0.411%、0.216%;干扰试验结果显示游离胆红素≤342.0μmol/L、结合胆红素≤342.0μmol/L、血红蛋白≤5g/L和乳糜≤2 400浊度时,对sFLC结果无明显影响;40例健康体检者中有1例κFLC测定结果超出厂家推荐的参考区间,40例λFLC检测值均在厂家推荐的参考区间内。结论 Beckman Immage 800全自动特种蛋白分析仪检测sFLC的主要分析性能符合质量目标的要求,能够为临床提供科学、准确的诊疗依据。     

血清中HBsAg浓度差异在乙型肝炎标志物模式分析中价值

目的分析不同浓度HBsAg血清中乙型肝炎标志物表现模式,以揭示其在人群中的分布特征。方法采用ELISA法与微粒子酶免疫分析技术(microparticle enzyme immunoassay,MEIA)测定5987例非肝炎流行区住院及门诊患者血清中HBsAg及其表面抗体(抗HBs)、乙肝e抗原及e抗体(HBeAg、抗HBe)和乙肝病毒核心抗体(抗HBc);根据定值参比血清和样本HBsAg荧光速率值/阴性对照荧光速率值之比(S/N值),再结合中和确证试验结果来确定HBsAg浓度,同时分析乙肝病毒血清学标志物模式;对低浓度(HBsAg≤1μg/L)再用PCR-ELISA法定量测定HBV DNA。结果:共检出HBsAg阳性784例,HBsAg浓度在5μg/L以上有636例,占HBsAg阳性81.1%;HBsAg浓度在2~5μg/L的有47例(5.99%);1~2μg/L的有69例(8.80%);1μg/L以下的有32例(4.08%)。尤其高浓度(HBsAg>5μg/L)和低浓度(HBsAg≤1μg/L)在人群中分布率分别为10.62%和0.53%;而中等浓度(1μg/L相似文献   

凝血酶促进结肠癌SW480细胞生长的研究

目的探讨凝血酶对结肠癌SW480细胞增殖及细胞周期的影响。方法将20 nmol/L、100 nmol/L、500nmol/L的凝血酶作用于SW480细胞48 h,以未处理组（0 nmol/L）作为对照。CCK-8（cell counting kit-8）法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化;RT-PCR检测蛋白酶活化受体-4（protease-activated receptor-4,PAR-4）的mRNA表达;Western blotting检测NF-κB p50蛋白表达。结果在20-500 nmol/L浓度范围内,凝血酶可剂量依赖性的促进SW480细胞的增殖;细胞周期显示G0/G1期细胞百分数减少,S期及G2/M期细胞百分数增加,表明凝血酶可诱导细胞从G0/G1期向G2/M期发展,从而促进细胞增殖;随着凝血酶浓度的增加,PAR-4 mRNA及NF-κB p50蛋白含量也有不同程度的增加。结论在20-500 nmol/L浓度范围内,凝血酶可促进结肠癌SW480细胞的增殖,加速细胞周期进程;其作用可经PAR-4介导,并与NF-κB信号通路活化有关。     

多发性骨髓瘤患者外周血单个核细胞微小RNA-202的表达及意义

目的 建立SYBR Green Ⅰ FQ-PCR检测人外周血单个核细胞(PBMC)中miR-202表达的方法,并初步探讨其检测MM的意义.方法 采用特异miR-202茎环引物逆转录后,用FQ-PCR对21例MM患者及20名健康人PBMC中miR-202表达水平做相对定量分析;结果用Mann-Whitney法进行两组间miR-202表达差异比较.此外,用1份1∶125稀释标本重复检测5次;及同一标本连续检测3d,每天检测1次,每次重复5管,根据循环阈值(Ct)计算标准差和变异系数(CV),以评价所建方法的重复性.结果 FQ-PCR检测PBMC中miR-202的扩增曲线呈标准的S型,熔解曲线峰值单一,未见杂峰,显示其特异性较好.批内CV为1.2％,批间CV为3.2％,当标本miR-202浓度被稀释为12.8 pmol/μl时,仍可稳定地得到扩增曲线.FQ-PCR检测MM组中miR-202表达量为1.844(0.162 ～3.966),健康对照组表达量为0.014(0.007～0.221),MM组中miR-202表达明显高于健康对照组(U=48.000,P＜0.01).结论 FQ-PCR是一种快速简便、特异性和重复性较好的检测miR-202的方法,MM患者PBMC中miR-202表达升高,其可能参与MM的发生过程,并有可能成为MM诊断和治疗的新指标.     

热休克蛋白gp96-肽复合物体外对人肝癌细胞的抗肿瘤效应

目的研究热休克蛋白gp96-肽复合物修饰树突状细胞(DC)后对人肝癌细胞的体外特异抗肿瘤效应。方法从人原发性肝癌组织中提取gp96-肽复合物,用其修饰DC细胞后与T淋巴细胞共同培养,以MTT法检测该复合物介导的细胞毒性T细胞(CTL)对不同来源人肝癌细胞的抗肿瘤效应,并与粗提抗原修饰DC细胞组相比较。结果 gp96-肽复合物诱导的CTL对原代肝癌细胞杀伤效率为74.3%,明显高于粗提抗原组(42.5%)和未加抗原组(14.4%)(P<0.01),粗提抗原组对肝癌细胞杀伤效率高于未加抗原组(P<0.01)。且该复合物的抗肿瘤效应具有一定的组织特异性。结论 gp96-肽复合物修饰的DC细胞,在体外能刺激产生特异的抗肿瘤细胞毒性T细胞,因而热休克蛋白gp96在肿瘤免疫治疗中具有重要的实用价值。     

靶向APRIL基因小干扰RNA对鼠肠癌细胞生长与迁移能力的影响

目的 制备并筛选靶向鼠结直肠癌细胞株CT-26增殖诱导配体(APRIL)基因小干扰RNA(siRNA),通过检测APRIL siRNA抑制肠癌细胞生长及迁移等指标,为体内递送APRIL siRNA靶向治疗小鼠结直肠癌原位模型奠定基础.方法 分别设计、合成4种不同位点的APRIL siRNA,同时以合成无序序列作为阴性对照,再用LipofectAMINE 2000转染高表达APRIL的鼠结直肠癌细胞株CT-26,荧光显微镜下计数评价6-FAM标记的APRIL siRNA转染效率与筛选转染浓度;FQ-RT-PCR检测APRIL mRNA水平,Western印迹分析APRIL蛋白表达,筛选沉默效率最高的APRIL siRNA片段;细胞损伤修复法检测APRIL siRNA抑制肠癌细胞迁移的能力;CCK-8(cell counting kit-8)法检测细胞增殖情况;RT-PCR检测基质金属蛋白酶MMP-2及TIMP-1 mRNA水平.结果 4种不同siRNA瞬时转染CT-26细胞后APRIL mRNA和蛋白表达有明显差别(P＜0.05).APRIL siRNA组与对照组相比,细胞生长与迁移能力明显减弱(P＜0.05),MMP-2及TIMP-1 mRNA水平均有显著性差别(P＜0.05).结论 成功筛选靶向鼠结肠癌细胞株CT-26增殖诱导配体APRIL siRNA,其中APsi737敲低效率可达到90%.靶向APRIL基因小干扰RNA可有效降低肠癌细胞的生长与转移能力,可能与MMP-2及TIMP-1的调节有关.可用于后续的靶向治疗结直肠癌研究.

Abstract：

Objective To construct and screen siRNA targeting a proliferation-inducing ligand (APRIL) gene in a mouse colorectal cancer celline, CT-26. To investigate the effects to the cell growth and migrant capacity of CT-26 after knockdown APRIL gene, lay the foundation for molecular targeted therapy to colorectal cancer. Methods Four pairs of APRIL siRNA were designed and chemically synthesized. And disorder sequences were synthesized as a negative control. These sequences were transfected with LipofectAMINE 2000 into CT-26 cells, which high-expressed APRIL gene. The transfection efficency rate of 6-FAM labelled control siRNA was detected by fluorescence microscope. The inhibition effectiveness of APRIL mRNA and protein was analyzed by FQ-RT-PCR and Western blot, respectively. Cell proliferation activity was analyzed by cell counting kit-8, cell migration capacity was detected by the repair of cell damage, and MMP-2 together with TIMP-1, two important regulatory genes in cell metastasis, were measured by RT-PCR.Results The different kinds of APRIL siRNA effectively suppressed the level of APRIL mRNA and the protein expression in CT-26 (P ＜ 0.05 ). Cell proliferation and metastasis ability were repressed after APRIL siRNA transfection( P ＜ 0.05 ), compared with random siRNA control and nontransfected control. The mRNA levels of MMP-2 and TIMP-1 genes wre significantly altered among APRIL siRNA groups and two control groups ( P ＜ 0.05). Conclusion We have constructed and screened a kind of siRNA (APsi737) targeting APRIL gene in a mouse colorectal cancer cell line, CT-26. APRIL siRNA can effectively inhibit the cell growth and migration capacity, maybe be regulated by MMP-2 and TIMP-1.