抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。     

嵌合轻链为模板导向筛选人源性抗肝癌抗体重链Fd片段

目的:利用噬菌体抗体库和导向选择技术,以抗HAb18G嵌合抗体轻链为模板,筛选人源性抗肝癌抗体Fd片段.方法:利用RT-PCR自肝癌患者外周血淋巴细胞中扩增全套人抗体重链Fd基因片段,克隆入含嵌合L链的展示载体pComb3X,建立人-鼠杂合Fab噬菌体抗体库.然后,利用大肠杆菌表达的非融合HAb18GE为抗原进行亲和筛选,利用pⅢ融合抗体的形式进行克隆鉴定,并对筛选出的杂合抗体进行初步的功能检测.结果:构建成功库容量为2×107PFU的杂合人-鼠噬菌体抗体库,利用非融合表达的HAb18GE进行6轮筛选.ELISA及流式细胞仪检测,其中7个克隆呈特异性阳性反应.其中克隆AP6-2和AP6-7亲和力较高,测序显示其基因序列相同,且与亲本抗体恒定区序列相同,属IgG2亚类,可变区属VH3家族.结论:通过本实验,利用嵌合轻链为模板,进行Fd片段替换,成功筛选到人源性抗体Fd片段.     

基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术

抗体等重组蛋白产品是以基因工程和细胞工程为关键技术的生物技术产品,其特异性高、均一性好、靶点明确,广泛应用于各类重大疾病、尤其是对肿瘤治疗。目前,在FDA批准的32种抗体药物治疗疾病的分类中,肿瘤类疾病占32％、免疫性疾病占37％、器官移植疾病占11％、感染性疾病占8％、心血管疾病占4％、其他疾病占6％。     

抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及序列分析

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)属肠杆菌科,为革兰氏阴性菌,兼性厌氧,周生鞭毛,无荚膜,无芽孢[1].该菌引起的原发感染或继发感染,对人或鱼类的致病性均较严重[2,3].为了构建迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗,我们应用RT-PCR的方法,从分泌迟缓爱德华菌抗独特型的杂交瘤细胞株1E11中克隆出抗体轻链可变区(VL)基因,并进行了克隆和序列分析.     

人源噬菌体Fab抗体库构建过程中引物的优化和初步鉴定

目的 优化设计一套引物，扩增全套人抗体Fd片段和L链基因，改善扩增效率，益于人源噬菌体抗体库的构建。方法 根据V-BASE数据库提供的人抗体可变区胚系基因，在其家族分类基础上，根据FR1区5’端保守序列重新分组，设计特异性的5’端扩增引物。同时对设计引物的匹配情况进行分析，并应用PCR扩增和测序反应对其扩增效果进行鉴定。结果 Fd链5’端扩增引物有5条，κ轻链有6条5’端扩增引物，而λ轻链5’和3’扩增引物有10条。分析表明，人抗体可变区胚系基因与5’引物有较好的匹配率，数目较少，匹配率较高。PCR结果显示，全部的重链及轻链引物对均能高效扩增出特异性较高的目的片段。测序结果表明PCR扩增产物具有较好的亚类和可变区家族分布。结论 优化了一套扩增全套人抗体Fd片段和L基因的引物，为人源噬菌体抗体库的构建奠定了良好的基础。     

肝癌细胞内HAb18G/CD147信号转导通路关键分子的筛选北大核心CSCD

目的筛选肝癌细胞内HAb18G/CD147信号转导通路中差异表达的关键分子。方法提取SMMC-7721细胞和T7721细胞(SMMC-7721经稳定转染并高表达HAb18G/CD147的肝癌细胞),应用信号转导相关基因芯片筛选两种肝癌细胞内差异表达的关键分子。结果基因芯片结果显示共有13个差异表达的基因,在高表达HAb18G/CD147的T7721细胞系中,表达下调的基因包括:骨形成蛋白(BMP)家族的BMP-2、BMP-5,内皮素1(ET-1),结缔组织生长因子-富含半胱氨酸血管生成诱导物61-肾母细胞瘤过表达基因(CCN)蛋白家族的WISP-2(Wnt1-induced signaling proteins-2/CCN5)和富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61/CCN1),前列腺干细胞抗原(PSCA);表达上调的基因包括:白细胞介素10受体α(IL-10Rα),趋化因子家族的IL-6、IL-8和CXC趋化因子配体2(CXCL2/GROβ),线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2),B因子(B factor)和转化生长因子β(TGF-β)诱导基因克隆3(βig-h3)的表达。结论共筛选出HAb18G/CD147信号转导通路相关的13个差异表达基因,这些基因与肝癌细胞免疫微环境重塑、血管形成、增殖、侵袭和迁移等生物学过程相关。     

治疗性单抗的免疫原性研究进展

治疗性单克隆抗体(Tberapeutic mAb)已经成为药物工业发展最快的领域之一,2003年到2004年之间其种类增长了48.1%.到目前为止,有26个治疗性单抗被美国食品药品管理局(FDA)批准应用于临床,超过150个抗体正在进行临床实验,其中包括8个鼠源性单克隆抗体、6个嵌合型单克隆抗体、11个人源化单克隆抗体和1个全人型单克隆抗体.这些抗体在临床上均取得了很好的效果,但是都不同程度地遇到了过敏反应和抗.     

不同免疫方案制备抗HAb18G/CD147胞外区多克隆抗血清的比较

目的:制备针对肝癌相关抗原HAb18G/CD147胞外区不同表位的抗血清,比较不同免疫方案的免疫效果.方法:以原核表 达的GST HAb18GEF融合蛋白、重组真核表达质粒pcDNA3/HAb18G及HCC细胞为免疫原,分别采用蛋白常规免疫、DNA肌 肉免疫及pcDNA3/HAb18G HCCbooster(DNA cellbooster)免疫接种BALB/c小鼠.采用间接ELISA和细胞ELISA,同时测定免 疫血清中抗变性和天然HAb18GEFIgG抗体的滴度和Ig亚类.用Westernblot检测各免疫方案制备的抗血清,与变性 HAb18GEF抗原结合的特异性.用免疫荧光法验证DNA cellbooster免疫接种法制备的抗血清,与细胞膜上天然HAb18G抗原的 结合特异性.结果:以GST HAb18GEF常规免疫后,可诱导高滴度的IgG1抗体产生,但针对的多为HAb18GEF的变性或线性表 位;以pcDNA3/HAb18G肌肉免疫后,可诱导针对其天然表位的IgG2a抗体产生,但滴度较低;以DNA cellbooster免疫后,可 诱导中等滴度、针对其天然表位的IgG2a和IgG1抗体产生.结论:不同免疫方案可诱导针对HAb18GEF不同表位、不同滴度的 多克隆抗血清,为淘筛针对其不同表位的多样性抗体奠定了基础.     

抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性

目的　分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链 ,并进行嵌合Fab复性的研究。方法　分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中 ,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL。转化大肠杆菌后诱导其表达。大量制备表达的嵌合Fd及嵌合轻链后 ,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性。然后 ,分别利用SDS PAGE、Westernblot和ELISA进行分析和鉴定。结果　成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达 ,表达蛋白相对分子质量 (Mr)均在 2 4×10 3 左右。表达量分别约占菌体总蛋白的 2 8.3%和 32 .3% ,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在。另外 ,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体 ,Mr 约为 4 2×10 3 ,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力。在起始总蛋白浓度为 10 0 μg/ml时 ,复性效率约为4 9 %。结论　成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性 ,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础     

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fd及轻链基因的克隆与鉴定

目的: 克隆抗人肝癌单抗HAb18 Fd及轻链基因，并对其可靠性和准确性进行验证。方法: 从分泌单抗HAb18的杂交瘤细胞株中提取总RNA，利用RTPCR扩增抗体Fd及轻链基因，连入pMD18T载体后，挑选阳性克隆进行序列测定并利用相应的软件对序列进行分析。然后将轻链及Fd基因依次克隆到噬菌体展示载体pComb3中，转化大肠杆菌XL1blue并利用辅助噬菌体M13K07进行挽救，收获噬菌体后利用间接ELISA方法检测其抗原特异性。结果: 扩增的HAb18全长轻链和Fd 基因大小分别为665 bp和668 bp，序列分析显示：VH及VL均含有2个特征性的半胱氨酸，CH1属于IgG1亚类，CL属于κ亚型。ELISA证实，Fab基因表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论：成功克隆了肝癌单抗HAb18的Fd及轻链基因，为下一步构建多种形式的基因工程抗体奠定了良好的基础。