生长抑制因子1基因核定位序列-绿荧光蛋白融合表达载体的构建及表达

目的构建p33^ING1b核定位序列（nuclear locating sequence，NLS）-绿荧光蛋白融合表达载体，将其转染到人胚肺纤维母细胞系MRC-5，建立稳定表达该融合蛋白的细胞模型。方法应用逆转录PCR获得p33^ING1b的NLS序列，然后将NLS序列插入绿荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，再用此载体转染MRC-5细胞系，观察活细胞绿荧光蛋白的亚细胞定位。结果成功构建了pEGFP-C1-NLS-绿荧光蛋白融合表达载体，由该载体表达的绿荧光蛋白-NLS肽段融合蛋白产生的绿色荧光信号全部定位于胞核部位，而空载体转染的细胞表达的绿色荧光蛋白，绿色荧光信号定位于细胞浆中。结论在活细胞内，生理情况下p33^ING1b完全定位于细胞核，并且在其亚细胞定位的转运过程中，NLS肽段起着决定性作用。     

高血压与高胆固醇血症对颅内动脉硬化形成的影响

目的:探讨高血压和高胆固醇血症单独或协同对颅内动脉退变的影响。方法:以雄性家兔为实验对象,分成4组:正常对照组(N组)、单纯高血压组(HT组)、单纯高胆固醇血症组(CH组)和高血压加高胆固醇血症组(HT CH组)。每日饲喂胆固醇造成高胆固醇血症,用双肾动脉狭窄法制成肾性高血压。实验结束后,兔脑标本全部HE染色,部分标本Masson、PTH和苏丹IV染色。另有部分标本进行电镜检查。结果:N组和CH组颅内脑实质内、外动脉未见明显异常。HT组光镜下可见脑实质内、外小动脉肌层增厚、血管收缩及透明变性。电镜下平滑肌细胞被激活,内皮细胞分泌物较多。在HT CH组,3只兔脑实质外较大动脉出现动脉粥样硬化病变。脑实质内、外小动脉病变与单纯高血压组所见相同。结论:单纯高血压可导致颅内小动脉发生动脉硬化;高血压和高胆固醇血症共同作用可导致脑实质外较大动脉发生动脉粥样硬化;而单纯高胆固醇血症不易造成颅内动脉退变。     

胶质瘤细胞ING1基因表达水平与肿瘤细胞增殖和凋亡的关系研究

目的探讨胶质瘤细胞ING1基因表达水平及其与肿瘤细胞增殖活性和凋亡程度的关系.方法采用原位杂交及免疫组织化学染色方法,分别检测71例不同级别的人胶质瘤组织ING1 mRNA及ING1、PCNA蛋白,并采用TUNEL法检测原位细胞凋亡的情况.结果ING1 mRNA的阳性表达率为94.6%(35/37),ING1蛋白的阳性表达率为90.1%(64/71),两者的表达水平呈正相关(γ=0.714,P＜0.01),均随肿瘤恶性程度的增高而降低,具有显著性差异(P＜0.05).ING1表达水平降低时伴随着凋亡程度的降低及增殖活性的增强.结论胶质瘤细胞中ING1基因的表达水平与肿瘤恶性程度密切相关,并随肿瘤恶性程度的增加而相应降低.其表达异常的改变主要是转录水平调控异常的结果,并可能通过促进细胞增殖和抑制细胞凋亡,在胶质瘤的发生、发展中发挥重要作用.     

胶质瘤VEGF、VEGF-C和VEGFR-3表达对间质血管生成及肿瘤细胞增殖的影响

目的 探讨胶质瘤血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和血管内皮生长因子受体-3(VEGFR-3)表达变化,以及对肿瘤细胞增殖和间质血管生成的影响.方法 收集2000-2009年手术切除WHO Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤标本各20例,采用组织微阵列技术及免疫组织化学染色(SPAB法)观察不同级别胶质瘤组织中VEGF、VEGF-C、VEGFR-3和Ki-67抗原的表达及CD31阳性血管密度.结果 60例胶质瘤组织中肿瘤细胞及间质血管内皮细胞VEGF、VEGF-C和VEGFR-3阳性表达率分别为88.33%(53/60)和100%(60/60)、100%(60/60)和16.67%(10/60)、100%(60/60)和21.67%(13/60),不同级别组间差异均无统计学意义(P＞0.05).Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级及Ⅳ级组的VEGF阳性肿瘤细胞密度分别为(17.65±9.00)、(37.30±18.54)和(83.40±22.98)个/0.05 mm2;VEGF-C阳性肿瘤细胞密度为(38.00±17.82)、(79.30±5.23)和(102.00±13.07)个/0.05 mm2;VEGFR-3阳性血管密度(3.65±2.01)、(10.50±3.98)和(14.60±7.29)血管数/4 HF;Ki-67抗原阳性肿瘤细胞密度(9.30±3.48)、(31.15±9.44)和(60.15±13.60)个/0.05 mm2;CD31阳性血管密度(6.75±2.24)、(10.35±2.98)和(14.30±3.51)血管数/4 HF,各组之间以上5种指标比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01),且彼此间均呈显著性正相关关系(r=0.663～0.910,P＜0.01).结论 胶质瘤细胞普遍过表达VEGF和VEGF-C,而胶质瘤间质血管内皮细胞则普遍过表达VEGFR-3,三者表达水平均随着肿瘤级别的升高而相应增加;由此形成的旁分泌环通过诱导间质血管生成促进肿瘤细胞增殖,在胶质瘤的发生、发展过程中起着重要作用.     

前脑缺血及再灌流损伤后大脑皮层内皮素、降钙素基因相关肽和神经元凋亡的研究

目的：探讨大脑皮层缺血及再灌流内皮素（ET）,降钙素基因相关肽（CGRP）与神经元凋亡的变化规律及关系。方法：以前脑缺血及再灌流不同时段的大鼠为模型。用放免法检测皮层ET和CGRP含量;TUNEL法检测原位细胞凋亡。结果：缺血后15分。ET低于正常和假手术组：再灌流后进一步降低。12小时达最低水平,6天后恢复,缺血后CGRP升高,再灌流后继续升高,12小时和1天达高峰后下降,6天时恢复正常,缺血后神经元凋亡增加,再灌流后继续增加,1天时达高峰后缓慢下降,8天时基本恢复正常,ET量与凋亡细胞呈负相关,CGRP量与凋亡细胞呈正相关。结论：缺血和再灌流均可导致神经元凋亡,CGRP在缺血及再灌注早期升高,其对神经元凋亡可能具有双重作用。     

大鼠缺血再灌流脑区半胱氨酸蛋白酶-3活化与神经元凋亡的关系

目的　探讨缺血再灌流脑区半胱氨酸蛋白酶 3(caspase 3)活性变化与神经元凋亡的关系。方法　采用WesternBlotting、原位细胞凋亡检测和免疫组化染色等方法,观察大鼠大脑中动脉栓塞 2h后再灌流 1、6、12、24h时,颞顶叶皮层缺血脑区caspase 3表达和活化、多 (ADP 核糖 )聚合酶(PARP)表达和切割灭活及神经元凋亡程度的变化。结果　再灌流 1、6、12及 24h组,缺血脑区的caspase 3前体及其 12 000切割片段含量的相对灰度值分别为 16 72±2 96、28 36±3 51、51 15±3 10、76 14±3 45及 8 17±2 31、15 36±1 39、31 23±5 43、58 95±6 28;PARP及其 24 000切割片段含量的相对灰度值分别为 12 63±3 02、22 65±4 38、30 81±3 16、67 49±8 59及 6 02±0 73、12 86±2 30、20 76±3 16、27 36±2 63;PARP阳性神经元及凋亡神经元的密度 (细胞数 /0 1mm2 )分别为 68 00±6 67、91 40±9 56、112 20±11 78、127 00±11 51及 83 31±7 53、100 70±6 16、121 53±7 21、197 36±11 78。以上 6种指标的变化彼此间均呈正相关 (r= 0 805 ~0 942, P<0 01 );除 6h与 12h组间PARP含量的差异及 6h与 12h组间和 12h与 24h组间PARP阳性神经元密度的差异无统计学意义外,上述 6种指标的其余组间差异均有统计学意义 (P<0 0     

绿色荧光蛋白报道基因在鼠C6胶质瘤细胞中的应用研究

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (GFP)报道基因转染C6鼠胶质瘤细胞的体内外表达及对细胞生物学性状的影响。方法 :荧光相差显微镜筛选稳定表达GFP的克隆 ,流式细胞术分析细胞周期。将已转染和未转染瘤细胞植入SD大鼠脑内 ,建立动物模型 ,定期随机处死大鼠 ,鼠脑标本行病理学、增殖与凋亡的检测 ,激光共聚焦显微镜检查肿瘤细胞内荧光强度及其分布。结果 :GFP在C6瘤细胞的体外和体内均获得长期稳定表达 ,检测肿瘤细胞的敏感性及特异性优于HE染色。结论 :GFP对肿瘤细胞生物学性状无影响是比较理想的报道基因     

脑肿瘤细胞增殖活性及凋亡与HLA-Dr表达相互关系的研究

目的探讨脑肿瘤细胞增殖活性及凋亡与人类白细胞抗原－Dr（HLA－Dr）表达的相互关系。方法用免疫组化和原位凋亡细胞检测方法现察分析了44例原发性脑肿瘤。结果增殖细胞核抗原（PCNA）、Ki－67抗原（Ki－Dr）阳性细胞和凋亡细胞阳性率均为100％，29例（67．2％）表达HLA－Dr。PCNA和Ki－67阳性细胞密度及HLA－Dr阳性率和阳性细胞含量均随肿瘤恶性程度增高而升高，凋亡细胞密度随肿瘤恶性程度增高而减少。HLA－Dr表达水平与PCNA和Ki－67阳性细胞密度呈平行升高，HLA－Dr－、＋、＋＋、＋＋＋组间的凋亡细胞密度无显著性差异。结论本组结果提示以上四种指标均能较客观反映脑肿瘤的恶性程度，HLA－Dr表达水平与脑肿瘤细胞增殖速度密切相关，细胞增殖与凋亡失衡可能是脑肿瘤发生发展的重要环节。     

硫酸软骨素酶ABC Ⅰ分泌型真核表达质粒的构建

目的 建立硫酸软骨素酶ABC Ⅰ(ChABC Ⅰ)的分泌型真核表达载体,并在胶质瘤细胞系中对其表达情况进行观察.方法 以真核表达载体pCDNA3.1/V5/HIS A为载体,将基底膜40蛋白信号肽编码区和ChABC Ⅰ成熟肽段编码区串联插入其多克隆位点,构建分泌型真核表达质粒pCDNA-BMS-CABC Ⅰ.采用该质粒转染人胶质瘤细胞系TJ905,培养3 d后将培养液上清液行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果 考马斯亮蓝染色显示有新条带出现,条带的相对分子质量大小与理论值一致,免疫印迹检测显示有V5免疫反应性特异性条带出现.结论 该真核表达载体可介导硫酸软骨素酶ABC Ⅰ在神经胶质细胞来源的细胞中以分泌蛋白形式表达.     

miR-146b-5p对胶质瘤TJ905细胞生长的抑制作用及其机制探讨

  目的  在TJ905胶质母细胞瘤细胞系中观察miR-146b-5p对MMP16的调控作用及其对细胞侵袭、迁移、增殖和凋亡的影响。  方法  分别用无义序列表达质粒(对照组)和miR-146b-5p表达质粒(P-miR-146b-5p组)转染TJ905细胞, 用qRT-PCR和Western blot检测两组细胞miR-146b-5p的表达水平及MMP16 mRNA和蛋白的表达水平, 用体外迁移侵袭实验及流式细胞术检测转染细胞迁移、侵袭、细胞周期分布和凋亡水平, 并分析这些变化的相互关系。  结果  与对照组相比, p-miR-146b-5p组MMP16 mRNA和蛋白表达量明显降低, 二者间呈正相关且均与miR-146b-5p表达量呈负相关。p-miR-146b-5p组侵袭和迁移细胞数均明显低于对照组, 并均与同组MMP16蛋白表达量呈正相关; 而凋亡水平明显高于对照组, 并与同组miR-146b-5p表达量呈正相关, 但两组细胞周期时相分布无显著性差异。  结论  miR-146b-5p是胶质瘤的抑瘤miRNA; 补充外源性miR-146b-5p可促进胶质瘤细胞凋亡, 并通过抑制靶基因MMP16表达阻止其侵袭迁移; 提示miR-146b-5p在恶性胶质瘤基因治疗方面具有重要的潜在应用价值。