海洋真菌Penicillium oxalicum SCSGAF 0023的次生代谢产物及其抗污损和酶抑制活性研究

利用pTLC、硅胶、Sephadex LH-20及半制备HPLC等柱色谱手段,从海洋真菌Penicillium oxalicum SCS-GAF 0023的次生代谢产物中分离得到16个化合物,波谱学数据分析鉴定为n-butyl isobutyl terephthalate(1),dibutyl terephthalate(2),1,3,7-trihydroxy-6-methylanthraquinone(3),1,6,7-trihydroxy-3-methoxy-anthraquinone(4),isorhodoptilometrin(5),citreorosein(6),emodin(7),methyl-3,8-dihydroxy-6-methyl-9-oxo-9H-xanthene-1-carboxylate(8),pinselin(9),secalonic acid D(10),quinolactacin C1(11),quinolactacin C2(12),quinolactacin A1(13),quinolactacin A2(14),quinolactacin B1(15),3-methyl-1H-indole-2-carboxylic acid(16)。其中,化合物1为新天然产物,化合物5和7表现出强的抗草苔虫幼虫附着活性,EC50值分别为3.8和6.0μg/mL;化合物10和15分别对PTPIB和cathepsin B显示中等的酶抑制活性,IC50值分别为24.0和16.0μM。     

利用土壤宏基因组技术定向筛选抗生素产生菌的方法学建立

为了快速从土壤中定向筛选抗生素产生菌, 本研究利用宏基因组技术进行了土壤中抗生素产生菌快速筛选方法的探索。对6 种不同土质的土壤利用液氮冷冻法提取土壤基因组DNA 并用PVPP柱层析法进行纯化, 每克湿土可得到32.25?61.25 μg DNA, 片段大小为23 kb左右, 说明宏基因组DNA样品完整, 16S rDNA的 PCR结果证明了该基因组DNA纯度可用于后期的分子操作。利用Herbimycin产生菌掺入法进行了抗生素产生菌筛选方法学的验证。结果证明, 每克湿土掺入103个Herbimycin产生菌时, 利用Herbimycin合成基因簇的特定引物即可从所提取的土壤基因组DNA中扩增出目标条带, 并且可以利用传统菌种分离方法从土壤中重新分离出来被掺入到土壤的Herbimycin产生菌。这些结果证明本研究建立的定向抗生素产生菌筛选方法, 具有快捷、灵敏的特点, 大大减少传统筛选方法的工作强度和时间, 为微生物新药的研发建立一种全新的研究方法。     

微生物来源的二氢乳清酸脱氢酶抑制剂F01WB-1315A，B

摘要：目的 从微生物次生代谢产物中筛选免疫相关疾病治疗药物重要靶点—－二氢乳清酸脱氢酶的抑制剂。方法 利用自建的快速、高效的二氢乳清酸脱氢酶抑制剂的高通量筛选方法,从4560株真菌菌株中筛选阳性菌株。阳性菌株的发酵产物进行分离纯化获得活性化合物,再通过对活性化合物的紫外、质谱、核磁等理化数据的分析进行结构鉴定。结果 筛选分离得到2个活性化合物F01WB-1315A和F01WB-1315B。F01WB-1315A对二氢乳清酸脱氢酶有强的抑制活性,IC50=0.07 μg/mL,于20 μg/mL浓度下对体外     

基于哺乳动物单杂交技术ERα调节剂高通量筛选模型的建立及应用

雌激素受体α(Estrogen receptor α,ERα)是一种类固醇核受体,在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选新的ERα调节剂,本研究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量ERα调节剂筛选模型。利用RT-PCR技术从脂肪组织总RNA中扩增ERα配体结合区(Ligand binding domain,ERαLBD)基因序列,并插入含GAL4DNA结合域的pBIND-GAL4表达质粒构建pBIND-GAL4-ERα(LBD)的嵌合表达质粒。该质粒与本室已构建好的含GAL4响应元件和荧光素酶的报告质粒pGL3-GAL4共转染,通过测定荧光素酶的活性评价ER调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优化,激动剂阳性药对照雌二醇可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达,最大上调倍增数可达28.1倍,EC50为0.17μmol/L。拮抗剂阳性对照它莫昔芬可以有效地拮抗雌二醇的活性,最大下调倍数为6.3倍,EC50为0.1μmol/L。该筛选模型可微量化于384孔板,且Z'因子均大于0.5。利用该模型从2000多个微生物和植物来源的天然产物以及合成化合物中筛选得到4个ERα激动剂。该模型灵敏、稳定,可以快速进行多...     

PPARδ激动剂高通量筛选模型的建立

为建立基于细胞瞬时转染的过氧化物酶体增殖物激活受体δ(peroxisome proliferator-activated receptor delta PPARδ)激动剂高通量筛选模型,用RT-PCR技术从肝的总RNA中扩增PPARδ基因序列,将其连至T克隆载体进行测序。将序列正确的PPARδ片段连接至pTARGET载体上构建表达载体pTARGET-ppARδ;将合成的3个拷贝的PPRE(peroxisome proliferator receptorresponse element)插入pGL3-promoter构成报告质粒pGl3-PPRE×3-luc。用脂质体转染技术将表达载体与报告质粒共转染细胞系,通过检测荧光素酶基因的表达状况评价化合物对PPARδ的激动活性。通过多种条件的优化,得到了最佳的共转染条件。阳性药苯扎贝特明显提高荧光素酶的表达,最大上调倍增数可达10倍,并且在一定浓度下阳性药与相对荧光酶的活性表达有较好的量效关系。该筛选模型灵敏、稳定,为对PPARδ激动剂进行药物研发和PPARδ机理的研究打下基础。