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1.
目的建立一种简便、快速、敏感、特异的适用于支气管败血波氏杆菌的PCR检测方法。方法根据兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)的fim2基因序列设计了一对特异性引物,进行PCR扩增、特异性和敏感性试验,并将其应用于临床样品的检测。结果利用该PCR方法扩增出425bp的目的基因片段,该产物序列与GeneBank上公布的基因序列同源性为100%。特异性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌均无交叉性反应;并且最小可检出菌液浓度为3.6CPU。用该PCR方法检测了从江苏、山东等地采集的146份兔鼻拭子,结果检出支气管败血波氏杆菌阳性92例,阳性率为63.01%。结论建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。  相似文献   
2.
目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌(Bb)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体(McAb),用间接ELISA、Western-blot等方法对McAb特性进行鉴定。结果获得两株能稳定分泌抗Bb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A7D5和D6B2,其小鼠腹水抗体效价分别为1∶409600和1∶102400;且不与兔大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等兔的常见病原菌反应,特异性强。两株单抗亲和力实验表明A7D5亲和力略高于D6B2。ELISA相加试验表明它们针对相同的抗原表位。结论成功建立了两株能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价高、特异性强,为今后建立该菌的免疫检测技术建立奠定了基础。  相似文献   
3.
目的表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)DNT蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌dnt基因序列(AB020025)针对其N-端设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pET-28a(+)载体中,以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白DNT1作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测支气管败血波氏杆菌重组蛋白DNT1抗体的ELISA方法。结果成功克隆了dntN-端的基因序列,并在E.coli BL21(DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白DNT1具有良好的抗原性。应用重组蛋白DNT1为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白DNT1抗原的包被浓度为6.25μg/mL,最适血清稀释度为1∶100。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了一种比较实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。  相似文献   
4.
目的表达支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列(AY376325)设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。  相似文献   
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