刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上，筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点，设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测，并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示，13个位点中有3个单态性位点，其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性，7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)~ 0.332(SNP160)之间，平均值为0.173；各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)~0.818(SNP9)之间，平均值为0.433；期望杂合度(He)介于0.031(SNP113)~0.834(SNP9)之间，平均值为0.402；多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)~0.393(SNP160)之间，平均为0.248，有6个位点偏离Hardy- Weinberg平衡。QTL验证结果表明，SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点，各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA)；SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点，各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型，发现二倍型K1(CC AA TT)抗病力最强，S1(CC AA)、S3(CC AC)在生长方面优势显著，相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

水产疾病远程会诊系统构建及其产业促进作用

综合应用多媒体计算机技术、网络通讯技术、视频会议系统、显微图像采集等多学科技术,并集成水产经济动物生物学数据库、疾病病原数据库和水产药物数据库,构建了我国北方水产疾病远程会诊系统。系统包括中心站、地区分站、会诊终端站、流动式终端站、技术专家组以及基层技术人员。利用该系统可实现中心站、分站与养殖企业间的水产疾病异地实时诊断,提高疾病诊断的准确率。同时,这套系统还可用于水产养殖技术工艺、疾病发生及防治等信息的远程教育、学术交流、远程传输、数据共享和在线检索等功能。     

养殖刺参保苗期重大疾病“腐皮综合征”病原及其感染源分析

2003～2005年冬、春季,山东省和辽宁省众多养殖区域的保苗期刺参(Apostichopus japonicus)暴发了较为严重的传染性疾病-"腐皮综合征".该病波及面广,传染性强,死亡率常高达90%以上.发病症状主要表现为厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡.本研究对症状较为典型的3家海参保苗期的发病幼参进行了详细的病原学分析,从所有病参的病灶组织分离得到了1种占有绝对优势的菌株,经人工感染实验证明它对健康刺参具有较强的致病性,且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同.通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明,导致保苗期刺参"腐皮综合征"的致病菌是假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens).同时也对3家养殖场刺参保苗养殖系统进行了分析研究.结果表明,水源中细菌含量不高,为(0.8×102)～(1.2×102)cells/mL,其特征与病灶处优势菌不同;而饵料中细菌含量最高可达3.2×106 cells/mL.饵料、池水和池底污物的优势菌与病灶处优势菌基本一致,说明饵料可能是病原菌的主要来源.本研究首次揭示了"腐皮综合征"导致保苗期刺参大规模死亡的原因及其致病原,对刺参健康养殖和病害防治具有重要的指导意义.     

刺参响应灿烂弧菌侵染的基因组DNA甲基化水平和转录组差异及其关联分析

为探讨病原菌胁迫下刺参(Apostichopus japonicus)基因组DNA甲基化水平和转录组表达的差异,本研究采用人工攻毒侵染胁迫,获得刺参化皮体壁组织,并以未攻毒组的健康体壁组织为对照,对刺参2种体壁组织进行全基因组甲基化测序(WGBS)和转录组高通量测序,解析刺参体壁基因组DNA甲基化差异,筛选响应病原胁迫的差异甲基化区域和差异表达基因。同时,通过基因组甲基化和转录组联合分析,筛选负相关关联基因,为解析刺参响应灿烂弧菌(Vibrio splendidus)侵染的分子机理提供基础数据。结果显示,刺参对照组和侵染组基因组总甲基化水平分别为(3.59±0.04)%和(3.87±0.27)%,侵染组甲基化水平显著升高;在发生甲基化的位点中,攻毒组和对照组的mCpG占比分别为83.06%和81.91%,mCpG为最主要的甲基化形式。本研究共筛选出差异甲基化区域(DMRs) 626 677个,注释到23 706个功能基因。转录组测序共检测到29 290个基因,筛选到差异表达基因496个,其中,上调基因214个,下调基因282个。在基因组甲基化与转录组的关联分析中,筛选到180个负相关关联基因,其中,差异甲基化区域位于启动子区域的负相关基因为60个。对负相关关联基因的GO和KEGG富集分析,筛选到相关通路和LRR、hsp20和CARD等关键基因。本研究将为解析刺参抗病的表观遗传调控机制提供数据,也为刺参抗病性状选育提供科学参考。     

基于gyrB基因的SYBR Green I实时定量PCR检测病原灿烂弧菌

灿烂弧菌Vibrio splendidus是多数海水养殖动物的主要致病菌,对养殖业危害较大。本研究根据灿烂弧菌gyrB基因的保守序列设计特异性引物,建立了SYBR Green I实时定量PCR检测灿烂弧菌的方法。构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,进行SYBR Green I实时定量PCR,在Tm为62℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.338x+37.67,相关系数为0.999,扩增效率为0.99,最低能检测到20个拷贝。实验结果表明,该检测技术具有较高的特异性、敏感性和重复性,对灿烂弧菌病的快速诊断和流行病学调查有重要意义。     

刺参养殖池塘中一种常见刚毛藻的调查及防控策略

对山东胶南地区刺参养殖池中常见的一种对刺参危害较大的刚毛藻品种进行了分类鉴定,并对其繁殖生长情况进行了调查研究,提出了相应的防控对策,以期为刺参室外池塘养殖期敌害藻类的防控提供参考。结果表明:该藻是曲褶刚毛藻(Cladophora flexuosa)。4月中旬,当池塘水温从13.5 ℃逐渐升高时开始出现;5月水温20 ℃左右时达到繁殖高峰,生物量达500 g·m-2;6月池塘水温升高至25 ℃后开始衰亡;7月水温达28 ℃后腐烂消亡。在刚毛藻繁殖初期应提高水位或及时清除池塘底部的刚毛藻,以防其大量生长,死亡后败坏水质,造成刺参死亡。     

迟缓爱德华氏菌SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

根据克隆得到的迟缓爱德华氏菌gyrB基因序列设计并合成一对特异性引物,通用性和特异性检测结果显示所设计的引物具有良好的种间特异性和种内通用性,构建含gyrB基因的重组质粒作为标准品,经过反应体系优化后建立了检测迟缓爱德华氏菌的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法线性关系良好,在Tm为63℃时,扩增产物的熔解曲线仅有一个单特异峰,扩增所得标准曲线为y=-3.32x 39.38,相关系数为0.998,扩增效率为1.00,最低能检测到60个拷贝。应用建立的方法对人工感染的大菱鲆病样进行了检测,三个被检样品均呈阳性反应,证明该方法具有较好的适用性。实验结果表明所建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量的优点,可用于迟缓爱德华氏菌病的快速检测。     

山东主要刺参养殖区幼参肠道抗生素耐药菌及耐药基因分布特征

为解析目前刺参(Apostichopus japonicus)苗种携带耐药菌及耐药基因现状，本研究从烟台、威海、青岛3个刺参主要养殖区的6家养殖场采集了幼参，对其肠道内容物中常用抗生素的耐药菌数量、占比和种类进行检测。利用荧光定量PCR技术，对样本中4类抗生素的7种耐药基因分布情况进行分析。结果显示，所检测的6个采样点中均有6种抗生素耐药菌的检出，从耐药菌占比来看，耐药菌占比最高的种类是乙酰甲喹、萘啶酸和四环素耐药菌，占比分别为0.05%~40.06%、2.16%~39.94%和0.06%~23.15%，氟苯尼考、庆大霉素和链霉素耐药菌的占比均不高，占比范围为0.01%~4.15%。由所分离到的98株耐药菌的鉴定结果可以看出，可培养的抗生素耐药菌分为4门5纲30属，主要集中在弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属，占检出率的15.30%、13.27%和12.25%。基于属水平的不同抗生素耐药菌种类的分布统计结果显示，各采样点耐药菌种类差异较大，而且弧菌属、芽孢杆菌属和嗜冷杆菌属中均存在同一菌属中有耐多种抗生素的情况。对6个样本7种抗生素耐药基因的丰度检测结果显示，同一类抗生素的不同耐药基因的含量差异显著，除氨基糖苷类抗生素耐药基因aadA的相对拷贝数比例和链霉素以及庆大霉素耐药菌占比之间存在显著相关性(P<0.05)外，其他抗生素耐药基因的丰度与耐药菌占比之间相关性不显著(P>0.05)。研究表明，苗期刺参中存在一定的携带耐药菌和耐药基因的风险。     

刺参养殖池塘中新敌害生物澳洲异尾涡虫的鉴定及其危害

为了对导致辽宁大连、山东东营的2家养殖场池塘养殖刺参大量化皮死亡的新的敌害生物进行鉴定并确定其对养殖刺参的危害。本实验通过形态学观察、分子鉴定及系统发育分析确定了涡虫的分类地位,通过生态学方法确定了其生态适应条件,通过切割后培养的方法观测了其再生能力,通过与刺参苗种的共培养实验测试了该物种对刺参的危害及其危害方式。形态学观察结果显示,该涡虫体长0.96～3.26 mm,体宽0.49～1.93 mm,外观黄色或黄褐色,头部钝圆,具一对暗红色棒状眼点,尾部具两条并列的尾垂;显微镜镜检发现其表皮下分布密集的虫黄藻,体表周生纤毛,雌雄同体,口后具有两个生殖孔;对该物种COⅠ及18S r DNA基因片段扩增测序结果进行分析,并构建基于18S rDNA基因的系统发育树,结果显示该生物与澳洲异尾涡虫序列同源性达99.64%,根据其形态学特征,并结合18S rDNA分子鉴定结果,将该生物鉴定为澳洲异尾涡虫;进一步对其生活习性进行了研究,结果显示,该生物具有避光性,其适宜温度为18～24°C,适宜pH为5.5～8.0,适宜盐度为20～40;再生实验表明,该物种具有很强的前后轴极性再生能力;该生物与刺参的共培养实验表明,澳洲异尾涡虫对刺参体表表现出很强的趋向性,可以吸附在刺参体表导致刺参苗种溃疡、化皮甚至死亡,但刺参的体腔、肠道、呼吸树内均未发现虫体寄生。研究表明,澳洲异尾涡虫是营自由生活的池塘养殖刺参的一种新的敌害生物,在养殖过程中需要密切关注并防范该敌害生物。     

基于toxR基因的轮虫弧菌荧光定量微流控快速检测技术的建立

以轮虫弧菌的单拷贝基因toxR基因的高保守区域为目的片段，设计特异性引物，构建重组质粒标准品，建立针对该菌的荧光定量PCR检测方法。以此为基础，实验选用UF-150 Genechecker微流控荧光定量PCR仪，通过优化反应体系和反应条件，建立了轮虫弧菌的微流控荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法能特异性扩增toxR基因目的片段，对轮虫弧菌纯培养物检测下限为1.34×10⁰ 拷贝/μL。在人工感染样品中的应用结果显示，对鱼体组织中轮虫弧菌的检测下限为1.34×10³ CFU/g，检测结果可以目视判读，检测时间缩短至42 min以内。研究表明，该检测方法具有特异性强、敏感度高、场地要求低等突出优势，适于开发水产病原实用性的现场快速检测技术。