禽流感病毒非结构蛋白1单克隆抗体的制备及其特异性分析

为研制禽流感病毒(H5N1)非结构蛋白1(NS1)的特异性单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性,本研究在分别表达了具有良好抗原性的A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白基础上,用A/Viet-nam/1194/04(H5N1)-NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光和免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,通过竞争抑制实验对单抗识别的抗原位点进行分析。结果共获得19株能识别4个H5N1-NS1蛋白不同抗原位点的mAb,亚类测定显示,5株为IgG2a、1株为IgG2b,另外13株为IgG1。这些mAb均与A/Vietnam/1194/04(H5N1)-NS1和A/HongKong/486/97(H5N1)-NS1重组蛋白特异性结合,免疫荧光检测均与A型流感病毒(H1N1和H3N2)有交叉反应,而与B型流感病毒无交叉现象。表明成功获得特异性针对H5N1-NS1蛋白的mAb,为进一步研究禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能奠定基础。     

人冠状病毒229E、OC43与SARS-CoV血清学相关性的研究

目的 检测正常人和SARS患者血清中3种人冠状病毒（229E、OCA3和SARS-CoV）特异性抗体．分析3种冠状病毒血清学相关性。方法 采用免疫印迹、免疫荧光和ELISA方法检测100例健康献血员、34例SARS患者恢复期以及11例SARS患者双份血清中229E、OCA3和SARS-CoV3种冠状病毒核衣壳（N）蛋白抗体。结果 用免疫荧光方法检测100例健康献血员血清中229E、OCA3和SARS-CoV IgG阳性率分别为98％、100％和1％，34例SARS患者恢复期血清中3种冠状病毒IgG的阳性率均为100％；免疫印迹检测100例健康献血员血清中229E、OCA3和SARS-CoVN蛋白IgG阳性率分别9r7％、99％和2％，34例SARS患者恢复期血清中229E、OCA3和SARS-CoVN蛋白IgG阳性率分别97％、100％和100％；11例SARS患者的急性期和恢复期双份血清中，免疫荧光检测有5例出现229E IgG滴度4倍或以上升高，10例出现OC43 IgG滴度4倍或以上升高，ELISA检测2例出现229EN蛋白IgG滴度4倍以上升高，没有一例出现OCA3N蛋白抗体滴度升高。结论 正常人群中普遍存在229E和OCA3两种人冠状病毒抗体，SARS-CoV感染者存在对人冠状病毒229E和OCA3血清学交叉反应，提示核衣壳蛋白不是引起血清学交叉反应的主要抗原，结果对研究SARS溯源有重要意义。     

简并PCR技术在肠道病毒血清型鉴定中的应用

目的 探讨共有序列简并杂合寡核苷酸引物PCR（CODEHOP-PCR）在肠道病毒血清型鉴定中的临床应用价值。方法 以CODEHOP-PCR检测经实时荧光RT-PCR鉴定为EV71和CA16 手足口病患者的临床样本和病毒分离培养细胞上清的肠道病毒VP1基因片段，经琼脂糖凝胶电泳并回收、测序，与Genbank提供的序列比较，确定肠道病毒的血清型。结果 CODEHOP-PCR后的序列分析表明，所有的EV71毒株和CA16毒株与近几年国内报道的部分毒株同源性在96%以上，其血清分型结果验证了实时荧光RT-PCR分型结果的准确性。结论 CODEHOP-PCR合并测序用于肠道病毒血清型的准确鉴定，与传统的病毒分离及血清中和试验相比，具有更快速、准确的优点。     

曲霉抗原双抗体夹心ELISA法特异性检测

目的 用2组曲霉单克隆抗体(mAbs)建立特异性识别不同种类曲霉抗原的检测方法.方法 采用天然烟曲霉抗原免疫,获得广谱针对曲霉抗原的单克隆抗体;采用重组烟曲霉抗原获得特异性针对烟曲霉抗原的单克隆抗体,用间接免疫荧光鉴定,并分别建立2种双抗体夹心ELISA法,对19种常见的环境和临床分离曲霉株、马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液进行检测.结果 间接免疫荧光显示,用天然烟曲霉抗原免疫获得的单克隆抗体(mAbs-1)可广谱识别多种曲霉分离株,而重组烟曲霉抗原获得的单克降抗体(mAbS-2)仅能特异性结合临床和环境分离的烟曲霉抗原.用mAbs-1建立的双抗体夹心ELISA法可检测19种常见曲霉株培养液;用特异性针对烟曲霉抗原单克降抗体(mAbs-2)建立的双抗体夹心ELISA法可特异性检测临床和环境分离株烟曲霉培养液;与其他曲霉株无交叉反应;2种双抗体夹心ELISA法与马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液均无交叉反应.结论 2种曲霉单克降抗体双抗体夹心ELISA法,除可广谱检测环境和临床分离曲霉株,还可以区分烟曲霉与其他曲霉,可作为监测环境、农产品、食品中的曲霉污染和早期诊断曲霉病的新技术手段.     

简化的两步法细菌内同源重组高效制备腺病毒质粒

目的 :应用简化的两步法细菌内同源重组高效制备腺病毒质粒。方法 :对细菌内同源重组法进行改进和简化 ,先构建含腺病毒基因组质粒pAdEasy 1的BJ5 183细菌 ,筛选出链霉素和氨苄青霉素抗性菌落 ,继而应用氯化钙法制作BJ5 183pAdEasy 1感受态细菌。用PmeⅠ酶使转移质粒pAdtrack CMV TK线性化 ,和BJ5 183pAdEasy 1感受态细菌混合进行转化 ,在含 12 5 μg mL卡那霉素的LB琼脂平皿上培养 ,筛选出卡那霉素抗性的细菌进行质粒抽提纯化 ,获得重组腺病毒质粒。结果 :卡那霉素抗性细菌有 2种 ,一种是含pAdeasy CMV TK(约 34kb) ,另一种含pAdtrack CMV TK(约 10kb) ,两者可经琼脂糖电泳加以鉴别。构建重组腺病毒质粒的成功率达 90 % (9 10 )。结论 :简化的两步法细菌内同源重组是一种简便易行、快速高效的腺病毒质粒构建方法     

构建学习型团队提高科研应急反应能力--从SARS科技攻关看应急科技攻关组织管理

本文通过分析珠江医院SARS快速诊断科技攻关的组织管理的成功经验,阐述了学习型组织在加强科研管理、组织研究团队、提高应对科技型突发事件的科学研究应急能力方面的运用,说明了精简的扁平化结构和团队学习在科研组织管理中的高效性,提出把学习型组织与科学研究相结合,组织学习型团队是提高科研应急反应能力的有效措施之一。     

化学发光免疫分析技术在严重急性呼吸综合征冠状病毒核衣壳蛋白检测中的应用

目的　建立一种可用于严重急性呼吸综合征(SARS)早期诊断的简便、快速、灵敏的实验室检测方法。方法　采用化学发光免疫分析方法 (Chemiluminescenceimmunosaasy, CLIA)测定 34种不同病毒培养上清和人血中SARS冠状病毒(SARS- CoV)核衣壳蛋白 (Nucleocapsidprotein, SARS- CoVN)。结果　6种不同SARS- CoV毒株测定均为阳性, 11种非SARS毒株测定均为阴性,最低可检出核酸定量为 6 3×10PFU/ml的SARS- CoV培养上清;测定 49例抗体阳性的临床血清样本,发热 6~10d的样本检出率最高可达 100%。结论　SARS -CoV的CLIA的灵敏度和特异性较高,且简便、快速,在SARS的早期诊断中有良好的应用前景。     

检测烟曲霉菌GM抗原生物素-亲和素-夹心酶联免疫吸附试验法的建立

本研究用重组烟曲霉半乳糖甘露聚糖 (ＡＦＭＰ1) ,制备免疫血清 ,建立一种以生物素 亲和素 (ＢＡ)系统为基础的夹心酶联免疫吸附试验 (ＥＬＩＳＡ)法 ,快速检测烟曲霉ＧＭ抗原[1] 。一、材料与方法1.动物和菌株来源 :家兔和豚鼠购自第一军医大学动物所 ,表达ＧＳＴ ＡＦＭＰ1融合蛋白ＢＬ2 1菌种及全部真菌标准株均由香港大学微生物系提供。2 .主要试剂 :ＧＳＴ融合蛋白纯化试剂盒、ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ 4Ｂ和ＥＣＬ底物显色剂 (ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ公司 ) ,弗氏佐剂 (Ｓｉｇｍａ产品 ) ,活化Ｓｕｌｆｏ ＮＨ…     

B型流感病毒核衣壳蛋白ELISA捕获法的建立和临床应用2

目的 制备和鉴定B型流感病毒核衣壳（N）蛋白单克隆抗体（mAb）,建立双抗体夹心捕获抗原ELISA,用于B型流感病毒感染的早期诊断。方法 用重组B型流感病毒N蛋白和B型流感病毒抗原免疫BALB/c小鼠制备mAb,采用ELISA间接法、免疫荧光（IFA）和免疫印迹（WB）进行筛选和鉴定,通过竞争抑制试验分析抗体识别表位,并采用抗体配对试验建立双抗体夹心捕获抗原ELISA法检测B型流感病毒 N抗原。结果 获得12株特异性针对B型流感病毒 N蛋白的mAb,识别8个不同的抗原位点,根据mAb识别抗原表位,对mAb进行多种组合的配对试验,筛选出2株单抗BN4和BN8混合作为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记的单抗BN1 和BN5混合作为测定抗体,建立了双抗体夹心ELISA法,测定新鲜的漱口液标本的灵敏度达100％,而对冻融的漱口液标本检测灵敏度为83.9％,与其他呼吸道病毒如A型流感病毒、副流感病毒等无交叉反应,特异度达100％。结论 获得特异性好的mAb,经过抗体的配对和优化,建立了一种灵敏度高、特异性强的B型流感病毒抗原的ELISA捕捉法,可用于B型流感病毒感染的早期实验室诊断及流行病学研究。