中温碱性脂肪酶的研究——Ⅲ.扩展青霉PF868变株碱性脂肪酶的纯化及其酶学性质

扩展青霉PF868变株发酵液经硫酸铵盐析和Sephadex-G-200及Sepharose4B柱层析纯化,获得纯化倍数为32.4的酶粉.该酶分子量为23442Dal.酶学特性表明:该酶的最适作用温度为32℃,50℃保温30min仍保留50%酶活性,最适pH为9.0,作用pH稳定范围在7.0—10.0之间.Ca~(2+)Mg~(2+)对酶有激活作用.Fe~(2+)、Cu~(2+)和Mn~(2+)对酶活力有抑制作用.     

强化类球红细菌辅因子NADPH再生以提高法尼醇的产量

法尼醇(Farnesol,FOH)是由焦磷酸异戊烯基(IPP)和焦磷酸二甲基烯丙基(DMAPP)合成的法尼酰基焦磷酸盐(FPP)去焦磷酸化作用生成的。在类球红细菌中IPP和DMAPP是由MEP途径生成,而完整的MEP途径需要消耗大量的辅因子NADPH,增加胞内NADPH的量有可能强化FOH的合成。文中从增加NADPH的生成和降低NADPH的消耗这两个策略出发,分别干扰了编码6-磷酸葡萄糖异构酶基因(pgi)和谷氨酸脱氢酶基因(gdhA)的表达,同时强化了磷酸戊糖途径中6-葡萄糖磷酸脱氢酶基因(zwf)和6-葡萄糖酸磷酸脱氢酶基因(gnd)的表达。实验结果表明,经改造的菌株NADPH含量显著增加,干扰菌株中菌株RSpgii的产量较高,为3.91 mg/g,在过表达的菌株中同时过表达zwf和gnd基因的重组菌株(RSzg)的FOH产量提高到了3.43 mg/g。为了获得FOH产量更高的菌株,以RSpgii为出发菌株,分别与zwf和gnd组合调控,获得的菌株RSzgpi的产量达到了最高量为4.48 mg/g,是出发菌株RS-GY2产率的2.24倍。     

深黄被孢霉高产脂变株的选育及其发酵的研究

以深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）AS3．3410为出发菌株,经紫外线,硫酸二乙酯和亚硝基胍复合诱变处理,选育成功高产脂深黄被抱霉M018变株,其摇瓶培养菌体油脂含量达65．6％,比出发菌株提高133％。60m³罐三级发酵培养菌体油脂含量高达79．2％,生物量达37．8g／L．气相色谱分析表明变株M018r-亚麻酸的含量比出发菌株提高了53％。连续传代试验表明M018是一稳定的变株。该变株油脂合成的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为酵母膏,最佳C／N为     

伯克霍尔德氏菌ZYB002脂肪酶lipC24基因的克隆、表达及其酶学性质

【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。     

热稳定性伯克霍尔德菌脂肪酶A突变体的筛选

摘要:【目的】为更好地提高伯克霍尔德菌ZYB002脂肪酶LipA在TMP纸浆造纸工艺中的应用,有必要利用蛋白质工程技术,提高其热稳定性。【方法】基于B-factor值筛选LipA多肽链中潜在的突变位点,利用迭代饱和诱变技术,构建突变文库,筛选热稳定性提高的突变体。【结果】利用上述方法,从4个突变文库中分别筛选到在55℃下,半衰期较野生型脂肪酶LipA分别提高了1.8倍、3倍、2.2倍和1.7倍的脂肪酶突变体。【结论】基于B-factor值选择突变位点,利用迭代饱和突变技术,快速筛选到热稳定性有显著提高的突变体。     

黑曲霉原生质体诱变选育果胶酶高产菌株

通过UV和NTG诱变筛选获得了2株高产果胶酶突变株。以果胶酶产生菌黑曲霉EIM6为诱变材料,采用1．5％的溶壁酶和1．5％的纤维素酶处理其对教生长期菌丝体2h获得高质量的原生质体。采用UV25S或50μg／mL NTG诱变30min,构建原生质体突变库,经刚果红果胶平板筛选获得果胶酶突变株,通过液体深层培养复筛获得高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5,酶活力分别从46598．08、46598．08U／mL提高至68596．57、68879．56U／mL,分别提高了47．21％、47．82％。连续8次传代经发酵测酶活力表明高产突变株EIM6-U11、EIM6-N5具有较高的遗传稳定性。     

葡糖酸醋杆菌内源复制片段的克隆

采用改进的碱裂解法提取Gluconacetobacter hansenii ATCC23769自发不产膜突变体的内源隐蔽质粒。用不同的限制性内切酶对混合质粒直接进行酶切,酶切后的片段混合物与pUC18载体连接构建重组载体。重组载体回转入G.hansenii ATCC23769获得隐蔽质粒上具有复制能力的片段,序列结果分析表明:该片段上没有某些其他质粒所具有的Rep蛋白。利用该片段,构建了能同时在大肠杆菌和葡糖酸醋杆菌中复制的质粒载体,体内的抗生素抗性实验证明该载体具有良好的稳定性。     

灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质

采用冻干浓缩、（NH4）2S04盐析、HiTrapphenyl（FF）疏水层析和QSepharose FastFlow离子交换层析对灵芝EIM-40发酵液进行分离纯化,获得纯化漆酶,纯化倍数为14．6,回收率为5．3％。SDS-PAGE银染的结果为单一条带,相对分子质量约为6．53×104。以愈创木酚和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）为催化底物进行酶学性质研究,最适pH分别为4．8和4．5,最适温度分别为55和50℃,2种底物在pH4．0。5．0范围内,温度低于50℃时,酶的稳定性都很好。以愈创木酚为底物,Km=645．0umol／L;以ABTS为底物,Km=22．2txmol／L。Cu2＋对该酶起激活作用,Fe2＋、Ca2＋、Ba2＋则完全抑制酶的活性。     

海洋破囊壶菌Thraustochytrium sp. FJN-10 DHA生物合成 途径相关延长酶的克隆与表达

二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是具有各种重要生理功能的高度不饱和脂肪酸.以海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10为研究对象,利用RT-PCR结合RACE,获得了两个碳链延长酶(TFD6和TFD5)的完整基因,其中TFD6 cDNA全长816 bp,编码271个氨基酸;TFD5 cDNA全长831 bp,编码276个氨基酸.将TFD6、TFD5酶切后分别连接到HindⅢ/Xba Ⅰ处理过的pYES2载体,醋酸锂法转化酿酒酵母感受态细胞,成功构建了延长酶酵母表达系统.气相色谱分析表明TFD6可延长C18:3n-6至C20:3n-6,TFD5可延长C20:5n-3至C22:5n-3.