鲢鱼骨骼肌肌球蛋白重链基因的cDNA克隆与表达

肌球蛋白分子含有2个约200kD的重链亚基和4个约20kD的轻链亚基,重链亚基由球状的头部(S1)和α-双螺旋的杆部(Rod)组成1。在鱼类肌肉蛋白质的组成中,肌球蛋白约占肌原纤维蛋白的50%以上,并且其基因在生物进化过程中的变异性很大,以致肌原纤维蛋白性质的变化主要是由肌球蛋白的变化引起的2。       

斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP2成熟肽在大肠杆菌中的融合表达

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏为基因克隆的材料,通过RT-PCR对编码LEAP2成熟肽区域41个氨基酸的cDNA片段(mLEAP2)进行克隆。根据斑点叉尾鮰与其他鱼类、哺乳动物及两栖动物等其他物种LEAP2成熟肽区域氨基酸序列的比对结果,发现存在14个保守的氨基酸残基,其中4个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽的羧基端区域,在空间上可形成两对二硫键,推测与LEAP2的抗菌活性有关。进一步构建重组表达质粒pET32a-mLEAP2,使mLEAP2基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,在25℃下,经0.7 mmol/L IPTG诱导培养16 h后,成功表达了trxA-mLEAP2融合蛋白。Tricine-SDS-PAGE显示,细胞经超声破碎后,上清和沉淀中均含融合蛋白,采用固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行纯化,得到了纯化的融合蛋白。     

茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理

以革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的铜绿假单胞菌为试验菌,通过测定茶多酚与两种菌作用前后细菌培养液的电导率和可溶性总糖的变化,以及菌体在磷代谢和蛋白质表达方面的变化,初步阐明了茶多酚对这两种菌的抑菌机理。研究结果表明,茶多酚对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均有抑菌活性,但对金黄色葡萄球菌的抑菌活性更强。经茶多酚处理后,细菌培养液的电导率和总糖浓度均增大,表明了茶多酚可破坏细胞膜的结构、导致细胞通透性增加,进而使细胞内容物外泄。另一方面,经茶多酚处理后的两种菌对磷的消耗量降低,以致严重影响了核酸、磷脂等细胞重要成分的合成以及能量代谢;通过SDS-PAGE分析,证实茶多酚可以阻碍细菌蛋白质的正常表达,以致影响其细胞的结构组成以及酶的催化活性,最终导致细菌正常生理功能的丧失。     

基于SOE-PCR的两种鱼类hepcidin基因串联及其在毕赤酵母中的表达

Hepcidin抗菌肽是由生物肝脏细胞表达的一类具有抗菌作用和铁代谢调节功能的碱性小分子肽,它们在机体免疫系统中发挥了重要作用,被认为是抗生素的理想替代品。通过重组DNA表达技术制备抗菌肽无疑是一条良好的途径。为扩大hepcidin的抗菌谱和提高其表达量,通过SOE-PCR将斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus hepcidin成熟肽的c DNA"m CH"与尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus hepcidin成熟肽的c DNA"m TH"进行串联,并在两端分别添加Eco RⅠ和NotⅠ酶切位点,以p PIC9K为真核表达载体,成功构建了"p PIC9K-m CH-m TH"重组表达载体;电转化进毕赤酵母GS115中,经不同浓度G418和选择性培养基筛选以及对酵母基因组DNA的PCR鉴定,得到高拷贝酵母转化子;在30℃、以1%的甲醇诱导表达不同时间后,经Tricine-SDS-PAGE分析,表明发酵培养72 h时目的蛋白的表达量最高,达77 mg/L。发酵上清经SP-Sepharose阳离子交换层析纯化后获得高纯度的目的蛋白。抑菌实验显示含目的蛋白的发酵上清和经纯化后的重组目的蛋白对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都有良好的抑菌效果。本研究结果为hepcidin抗菌肽的产业化生产奠定了良好的基础。     

基于多拷贝鳜鱼β-防御素基因的重组毕赤酵母菌株构建

鳜鱼β-防御素(Siniperca chuatsi β-defensin,ScBD)作为一种重要的蛋白质免疫因子,在其抵御病原微生物侵染的过程中起到了重要的作用,被认为是开发天然抗菌剂的理想候选者.ScBD的初级结构含信号肽和成熟肽,后者由43个氨基酸残基组成,决定了其生物学活性.通过同源建模法预测了ScBD的空间结构...     

三疣梭子蟹C型溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其抑菌活性

C型溶菌酶是存在于各种生物组织中的重要的先天性免疫蛋白,是开发天然抑菌剂的良好候选者。以甲壳类动物三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)C型溶菌酶成熟肽为研究对象,首先通过RT-PCR克隆其编码基因"ptlyC";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-ptlyC,电转至毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33后,通过高浓度的博来霉素筛选到高拷贝酵母转化子;在28℃、250 r/min和pH6.0的条件下,经1%的甲醇诱导表达72 h,得到含重组ptlyC的培养液上清;经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化,得到分子量约为25.3 kD的纯化产物。通过菌落计数法证明含重组ptlyC的培养液上清具有抑制革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的活性;通过琼脂糖凝胶扩散法证明纯化的重组ptlyC具有抑制革兰氏阴性的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和沙门氏菌(Salmonella lignieres)的活性。     

三疣梭子蟹PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的表达

Crustin主要分布于甲壳动物中,是一种富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,在甲壳动物的先天免疫系统中发挥重要作用。根据crustin的一级结构特征可以将其分为不同的类型,本文以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的PtCrustin2成熟肽为研究对象,通过构建毕赤酵母表达系统,以期实现PtCrustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达。首先,从其鳃中提取总RNA,通过RT-PCR得到编码PtCrustin2成熟肽的cDNA(m Pt Crustin2),并在其5'和3'端分别引入EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶位点;然后将此片段与表达载体p PIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-m Pt Crustin2;电转入毕赤酵母GS115细胞后,以不同浓度的G418筛选到高拷贝酵母转化子,经0.5%甲醇诱导表达和固化金属离子亲和层析(IMAC)分离,获得了纯化的重组体mPt Crustin2,Tricine-SDS-PAGE分析显示其分子量约10.5 k Da;抑菌实验证明重组体mPtCrustin2对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌具有一定的抑菌效果。本研究首次实现了三疣梭子蟹Pt Crustin2成熟肽在毕赤酵母中的重组DNA表达,为进一步研究提供参考。     

重组毕赤酵母产青蛤Mytimacin抗菌肽的表达研究

Mytimacin是主要在无脊椎动物中表达的Macin抗菌肽家族中的一员,具有较强的抗病原微生物活性,是利用重组DNA技术开发天然抗菌剂的良好候选者。通过RT-PCR从青蛤(Cyclina sinensis)闭壳肌中克隆编码Mytimacin成熟肽的基因,经3次PCR在该基因的5’端添加Xho I限制性酶切位点和信号肽酶识别位点、3’端添加Xba I限制性酶切位点和6×His,获得目的基因"CsMm";以pPICZαA为表达载体、毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33为工程菌,构建重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm。通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,在28℃、250 r/min条件下,使用1.5%的甲醇诱导表达72 h;使用固化金属离子亲和层析(IMAC)对表达产物进行纯化,并通过MALDI-TOF-TOF质谱分析对纯化产物进行鉴定。另外,通过涂布法和浊度法考察重组CsMm的抑菌活性。结果表明:基于X-33/pPICZαA-CsMm重组毕赤酵母的外源表达获得了表达量为25.6 mg/L的重组蛋白,经MALDI-TOF-TOF质谱鉴定其为分子量约7.8 kD的预期重组CsMm。抑菌试验证明重组CsMm对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)和副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)具有明显的抑菌活性。构建的重组毕赤酵母X-33/pPICZαA-CsMm能有效合成具有生物学活性的重组青蛤Mytimacin,旨为贝类来源天然小分子抗菌剂的开发提供可资参考的技术途径。     

斑点叉尾鮰BPI抗菌肽的cDNA克隆及原核表达载体的构建

杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是生物机体细胞中表达的一种能够特异性杀灭革兰氏阴性菌的抗菌类蛋白,该蛋白包括氨基端和羧基端两个结构域,其中氨基端结构域主要承担杀菌和中和内毒素的功能.参考已经报道的对人类BPI进行重组DNA表达的研究结果,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鲴(Ictalurus punctatus)鳃中克隆了编码BPI氨基端活性结构域的cDNA片段“BPINtd”,该片段由175个氨基酸残基组成,其中63个氨基酸残基在空间上形成一个非极性的脂质结合袋,与革兰氏阴性菌外膜上脂多糖(LPS)结合,从而改变细菌膜的通透性,达到杀菌的效果.根据斑点叉尾鲴与其他生物之间BPI氨基酸序列的比对结果,发现氨基端存在40个保守的氨基酸残基,其中9个高度保守的残基位于脂多糖结合区域内.为了进一步建立原核表达系统,根据pET-32a(+)和pET-28a(+)两种质粒的不同特点,选择其作为原核表达质粒,将“BPINtd”片段分别插入两种质粒,通过菌落PCR、EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切反应以及DNA测序等方法,证明了重组表达质粒“pET-32a-BPINtd”和“pET-28a-BPINtd”已被成功构建.     

斑点叉尾鮰NK-lysin基因的cDNA克隆及融合表达质粒构建

以斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)NK-lysin-type1的成熟肽为研究目标,首先通过RT-PCR和巢式PCR从斑点叉尾鮰的鳃中克隆到编码NK-lysin成熟肽的基因,该基因编码由92个氨基酸残基组成的成熟肽;6个高度保守的半胱氨酸残基位于成熟肽内,它们被推测与NK-lysin的抗菌活性有关。为了进一步构建原核表达系统用于成熟肽的表达,pET-32a(+)被选择作为融合表达质粒,该质粒含有1个trxA融合头基因,与目的片段mNK-lysin连接后形成融合基因trxA-mNK-lysin,进而有助于在工程菌E.coliBL21(DE3)中的可溶性融合表达。通过PCR、EcoR I和HindⅢ双酶切处理以及DNA测序鉴定,证明pET-32a-mNK-lysin重组融合表达质粒已经被成功构建;将其转化至工程菌E.coliBL21(DE3)后的测序结果表明该重组质粒未发生任何DNA变异。