毕赤酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的高表达及纯化

用PCR方法从毕赤酵母(Pichia pastoris)基因组DNA扩增甲酸脱氢酶(FDH)基因,通过定点突变密码子TAG(649-651位碱基)为GAG,突变后的基因片段插入表达载体pET-22b( )构建质粒pET-FDH,转化E．coli BL21(DE3)。基因工程菌在IPTG诱导下高效表达可溶性的FDH融合蛋白,蛋白的表达量占基因工程菌株总蛋白的30%。工程菌破壁上清液采用一步亲和层析分离,得到比活力为6．45U/mg的重组FDH。     

固定化嗜热脂肪芽孢杆菌连续合成半乳糖寡糖的研究

利用固定了产β-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢杆菌,以乳糖为底物,在纤维床反应器中连续合成半乳糖寡糖(GOS),最高得率为50.7%。在连续反应体系中,研究了底物浓度、pH、反应温度和停留时间对半乳糖寡糖合成的影响,确定最佳反应条件为底物浓度450 g/L、反应温度55℃、pH7.0、停留时间100 min。在连续反应24h后,流加1.5%的D-半乳糖能提高合成GOS的能力,固定化细胞反应体系中连续稳定操作120 h。     

嗜热脂肪芽孢杆菌的β—半乳糖苷酶合成低聚兰乳糖动力学模型

根据反应机理和产物的化学结构,建立了嗜热脂肪芽孢来源的β－半乳糖苷酶催化乳糖水解和转半乳糖苷反应偶合的动力学模型,模型中包含了低聚三糖和低聚四糖的生成。通过优化计算,估算反应动力学参数,结果表明该模型能较好地与实验结果相吻合。     

半乳糖寡糖在体内和体外对双歧杆菌生长的影响

目的:利用固定化产β-半乳糖苷酶的嗜热脂肪芽孢杆菌连续合成的产物。方法:经柱层析分离纯化得到了纯半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖,用于体外双歧杆菌培养和动物试验。结果:证实了半乳糖寡糖能高效、专一地促进双歧杆菌的生长繁殖。结论:半乳糖寡糖具有改善小鼠肠道内菌群分布,降低小鼠盲肠内pH值的生理功能。     

原核生物细胞色素P450酶系及其应用

细胞色素P450酶系广泛分布于各种生物中,它们通常由一组基因超家族编码并含有血红素,能够催化一系列化学反应,具有多种生物学功能。特别是原核生物P450酶在催化内源性和外源性化合物的反应中具有重要的工业生产应用价值,成为近年来P450酶系研究的热点。本文对近年来原核生物P450酶系的重组表达和生物催化领域的研究进展进行综述。     

一种具有立体选择性新酯酶的菌种筛选和基因克隆

从土样分离到一株产生具有立体选择性酯水解酶的恶臭假单孢菌(Pseudomonas putida NH33)。构建P.putida NH33的基因组文库,并在E.coli中进行酯酶活性筛选,得到一个含有4.7kb插入片段的阳性克隆。对这个克隆的DNA片段进行序列分析,表明它含有一个1142个碱基的开放阅读框,为编码381个氨基酸的酯酶。推测的酯酶氨基酸序列与其它丝氨酸酯水解酶具有共同的保守基序GXSXG。把该蛋白在E.coli BL21(DE3)中进行表达,并用金属亲和层析纯化至单一条带。利用纯化的酶水解2-芳基丙酸乙酯制备2-芳基丙酸的S型异构体,产物的光学纯度ee_p>99%,说明此酶可8用于手性药物的合成。该酯酶是一个新酶,其基因序列已递交GenBank,登记号为AY896293。     

固定化嗜热脂肪芽孢杆菌合成低聚半乳糖

利用海藻酸钙、明胶和壳聚糖为固定化载体包埋嗜热脂肪芽孢杆菌细胞合成低聚半乳糖 (GOS)。通过比较三种方法的酶活力回收、最适反应条件、GOS的得率和和载体机械强度 ,选择明胶作为固定化细胞的载体。反应体系的温度、pH、乳糖浓度、乳糖的转化率和载体的传质阻力对GOS合成有明显影响。在CSTR反应器中水解 60 %乳糖 ,GOS最大得率为31 2 % ,经过 96h( 8批反应 ) ,产物得率为原来的 88%。在空速 0 0 9h- 1条件下 ,利用填充床反应器连续水解乳糖 ,GOS的得率和反应器生产能力分别为 31 5%和 1 7 4g (L·h) ,连续反应1 40h,GOS得率下降 2 0 %。产物经过活性炭柱层柱分离纯化 ,通过13C NMR鉴定四糖的化学结构为 β D Gal ( 1→ 3) D Gal ( 1→ 6) D G ( 1→ 4) D Glu。     

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶合成低聚半乳糖动力学模型

根据反应机理和产物的化学结构,建立了嗜热脂肪芽孢来源的β-半乳糖苷酶催化乳糖水解和转半乳糖苷反应偶合的动力学模型,模型中包含了低聚三糖和低聚四糖的生成。通过优化计算,估算反应动力学参数,结果表明该模型能较好地与实验结果相吻合。     

宏基因组学在新型生物催化剂开发中的研究进展

宏基因组学是基因工程发展的新方向,它为寻找和发现新的功能基因及生物催化剂提供了新的研究策略。着重论述了宏基因组学的研究方法,包括DNA的提取、文库的构建以及筛选策略的选择。同时介绍了近年来宏基因组学应用于新型生物催化剂开发中所取得的一些成果。     

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 pH分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β-