CMG2-Fc 融合蛋白突变体筛选及中和炭疽毒素活性分析

目的:筛选能有效中和炭疽毒素和抵抗炭疽毒素损伤细胞的CMG2-Fc(炭疽毒素受体II-人免疫球蛋白Fc段融合蛋白)突变体。方法:运用FoldX等计算软件分析CMG2与PA晶体学结构,设计能提高CMG2-PA亲和力的突变体分子,并与人IgG1Fc片段构成融合基因,转染CHO-S细胞并通过亲和层析获得CMG2-Fc突变体蛋白,通过亲和力检测和细胞保护实验分析各突变体中和炭疽毒素能力。结果:筛选并表达了8个CMG2-Fc突变体分子,亲和力实验显示其中E117Q突变可明显提高CMG2-Fc与PA的亲和力(KD=1.35×10-11 mol/L),细胞保护实验提示E117Q突变能有效提高CMG2-Fc中和炭疽毒素能力(CMG2-Fc(E117Q)的IC50为15 ng/μL,而wt CMG2-Fc的IC50为50ng/μL)。结论:CMG2-Fc(E117Q)突变体分子可作为拮抗炭疽毒素损伤的炭疽治疗药物分子,进行进一步研究。     

非洲猪瘟研究进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染家猪或野猪后引发的一种急性、烈性传染病,主要通过病猪及其周围环境传播,蜱是中间宿主。1921年该病首次暴发于非洲肯尼亚,2018年8月传入我国,目前已有24个省级行政区发生疫情。非洲猪瘟病毒主要经呼吸道和消化道进入猪体内,感染靶细胞主要是单核-巨噬细胞,目前受体还不明确。非洲猪瘟病毒是单分子双链DNA病毒,长度为170~190kb,编码150~200种蛋白,包括多种免疫调控蛋白,可以抵抗机体免疫。非洲猪瘟病毒疫苗研究较多,包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等,但迄今这些疫苗都不能保护家猪免受非洲猪瘟病毒感染。今后需要对非洲猪瘟病毒及其发病机制做详细系统的研究,为开发有效防治方案提供资料。     

炭疽受体CMG2-Fc 融合蛋白在CHO 细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力。方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

炭疽受体CMG2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定

目的：构建炭疽受体CMG2和人IgGl Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素（PA＋LF）的能力。方法-将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgGl的Fc片段基因共同连接入pcDNA3．1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264．7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果：获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论：CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。     

炭疽毒素受体结构和功能研究进展

肿瘤血管内皮标志物8(TEMS)和毛细血管形态发生蛋白2(CMG2)是已知的两个炭疽毒素受体,它们的主要功能是当炭疽杆菌侵染细胞时介导炭疽毒素进入宿主细胞.这两个受体都是涉及到细胞外基质动态平衡的I型跨膜蛋白,并且都因为它们在血管生成或血管内皮细胞中表达增强而被发现.有研究发现TEM8能够调节内皮细胞迁移和血管形成,而CMG2则在内皮细胞增殖过程中起重要作用.进一步的研究显示它们与整联蛋白同源性较高,但它们确切的生理功能和作用机制尚不明确.本文中,主要讨论这两种蛋白的结构和它们作为炭疽毒素受体介导炭疽毒素进入细胞的分子机制,然后我们简单探讨一下TEM8在靶向肿瘤血管内皮细胞的抗血管生成和抗肿瘤疗法方面的研究进展,最后我们展望了下一步炭疽毒素受体研究的热点-它们的配体及生理功能研究.     

重组人尿激酶原冻干产品的稳定性

目的：探讨重组人尿激酶原（rhPro-UK）冻干产品的稳定性。方法：采用S-2444发色底物法测定贮存在4℃和-20℃的rhPro-UK冻干产品的活性、单链比例随时间的变化规律;用SDS-PAGE及RP-HPLC肽图分析贮存在-20℃的rhPro-UK冻干产品的结构与组成的变化。结果：4℃保存3年后的rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例基本没有变化,但随着贮存时间的延长,有部分产品降解,如贮存78个月的样品,总活性可降低13％～15％;-20℃保存78个月后,rhPro-UK冻干产品的总活性和单链比例未见明显变化。SDS-PAGE及RP-HPLC肽图图谱显示,-20℃贮存78个月后的rhPro-UK冻干产品的组成和结构没有变化。结论：rhPro-UK冻干产品在4℃的贮存寿命可达3年;长期贮存于-20℃的rhPro-UK冻干产品,其总活性、单链比例及结构组成非常稳定。     

肺癌患者血浆外泌体蛋白质组分析

目的:探究肺癌患者与肺部良性结节病人血浆外泌体中蛋白质组的差异。方法:收集肺癌与肺部良性结节病人的术前血浆,随机选取肺腺癌病人血浆15例、肺鳞癌病人血浆10例作为实验组,肺部良性结节病人血浆5例作为对照组,采用超速离心法分离得到外泌体,定量质谱鉴定分析肺癌病人与肺部良性结节病人血浆外泌体蛋白质表达的差异性,SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹法检验提取到的蛋白质。结果:共检测到血浆外泌体蛋白质253个,并初步确定其中18个在肺癌病人血浆外泌体中表达上调,8个在肺癌病人血浆外泌体中表达下调,免疫印迹法验证了上调蛋白质中的补体蛋白C4a。结论:鉴定出26个外泌体差异表达蛋白质,为肺癌早期诊断提供了新的候选分子。     

肿瘤细胞外泌体中融合基因的检测

目的:探究肿瘤细胞分泌的外泌体中是否可以检测到来源于源细胞的融合基因m RNA。方法:培养人非小细胞肺癌NCI-H3122细胞,采用外泌体试剂盒提取细胞上清中的外泌体,并用Western Blot实验验证外泌体是否提取成功。分别提取外泌体以及H3122细胞中的总RNA,将RNA反转录为c DNA,通过PCR反应扩增v1型EML4-ALK融合基因片段,经琼脂糖凝胶电泳确定目的条带后,将两种PCR产物送公司进行基因测序,最后对测序结果进行比对分析。结果:从H3122细胞上清中成功提取了外泌体,并且在外泌体中检测到来源于H3122细胞的m RNA;从H3122细胞外泌体中检测到EML4-ALK融合基因,并发现外泌体中的EML4-ALK融合基因的融合形式为V1,与在H3122细胞中检测到的EML4-ALK融合基因的融合形式完全相同。结论:肿瘤细胞分泌的外泌体中可以检测到肿瘤细胞来源的m RNA,并且外泌体中的m RNA可以反映肿瘤细胞m RNA的基因融合情况等生物学特性。     

一种体内标记转录RNA的新技术

目的:验证一种体内标记转录RNA的新技术,并用该技术观察一种长寿药物雷帕霉素对真核细胞HEK293中RNA合成的影响。方法:将尿嘧啶类似物5-乙炔尿苷(EU)和雷帕霉素加到HEK293细胞培养基中,共同孵育2h,然后在激光共聚焦显微镜下对EU标记的新合成RNA进行观察;用Image-pro plus软件对图像的荧光强度进行分析,获得反应荧光强度的平均光密度数值;用SPSS软件对数值进行统计分析。结果:激光共聚焦显微镜下,可见EU标记的新合成RNA主要分布在胞质和核仁中,以核仁中荧光最强;Image-pro plus软件和SPSS软件分析表明,加入雷帕霉素前后,细胞新合成的RNA平均光密度无明显差别。结论:EU是一种安全、简单、快速而灵敏的检测新合成RNA的新技术,用该技术检测表明长寿药物雷帕霉素不影响真核细胞HEK293中总RNA的合成。     

核糖体蛋白rpS6在核仁中的定位与其磷酸化无关

核糖体蛋白S6(rpS6)是核糖体小亚基40S的一个组成成分。在该研究中,利用免疫荧光和邻位连接技术证明rpS6不仅是核糖体小亚基的组成成分,而且还可与核仁中的U3核蛋白复合体的标志性蛋白Mpp10共定位并且存在相互作用。rpS6蛋白的C端有5个丝氨酸磷酸化位点,为了研究rpS6蛋白在核仁中的分布是否与其磷酸化有关,构建了rpS6蛋白的两个突变体rpS6A和rpS6D分别与EGFP和HA的融合蛋白。rpS6A是将C端的5个丝氨酸位点全部突变为丙氨酸;rpS6D是将C端的5个丝氨酸位点全部突变为天冬氨酸。研究表明:rpS6、rpS6A和rpS6D与EGFP和HA的融合蛋白均可分布在核仁中,与内源性rpS6蛋白的分布情况一致,说明rpS6蛋白在核仁中的定位与其磷酸化无关,为探索rpS6蛋白在核仁中的功能奠定了良好的基础。