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为研究人白细胞介素 18(hIL 18)结构与功能的关系 ,用PCR定点突变技术分别构建了N末端、C末端缺失突变体(ΔNC)和IL 1特征样序列突变体S154A/Y156F/E157P/C163 T (S)。将突变体cDNA与原核表达载体 pJW 2重组并转化大肠杆菌DH5α ,经热诱导表达蛋白质 ,SDS PAGE证实表达的目的蛋白质以包涵体形式存在。菌体经超声破碎后 ,包涵体以 2mol/L尿素洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,并经SephadexG 75柱纯化 ,纯度可达 95 %以上。突变体蛋白质经逐步稀释复性后 ,以诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生干扰素 γ(IFN γ)及对核因子 κB(NF κB)的激活能力为指标 ,检测突变体的生物学活性。结果显示ΔNC、S这 2个突变体对IFN γ的诱生能力显著低于野生型hIL 18,分别为野生型hIL 18的 13%和 4 8%。同时 ,ΔNC、S对NF κB的激活能力也低于野生型hIL 18,分别为野生型hIL 18的 6 9.7%和 89.8%。这些结果表明缺失的片段或突变的位点对hIL 18的功能有重要的作用。 相似文献
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为研究IL 18结构与功能的关系 ,用重叠延伸PCR定点突变技术构建人白细胞介素 18(hIL 18) 4个半胱氨酸的突变体hIL 18C74 S、C10 4 S、C112 S和C163 S。将突变体的cDNA与原核细胞表达载体pJW2重组并转化大肠杆菌JM10 1。经热诱导后 ,4个突变体在大肠杆菌中均得到了高效表达。表达的蛋白质主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎 ,2mol/L尿素洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,SephadexG 10 0柱纯化后 ,纯度可达 90 %以上。以诱导人外周血单个核细胞 (PBMC)产生IFN γ的能力为指标检测复性突变体的活性。结果显示除C10 4 S外 ,其他 3个突变体的生物活性均低于野生型hIL 18,C74 S、C112 S和C163 S的活性分别是野生型hIL 18活性的 5 %、5 8%和11%。证明Cys74 、Cys163 为hIL 18诱导产生IFN γ的功能所必需 相似文献
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人白细胞介素18在大肠杆菌中的表达,纯化和复性 总被引:7,自引:0,他引:7
用RT-PCR从PHA刺激的人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出人白细胞介素18(IL-18)的cDNA,克隆到表达载体pJW2中,经热诱导后在大脾性杆菌中得到高效表达。表达的重组IL-18占菌体总局旧白质的20%,表达的蛋白南分子量约为18KD,与预期分子量相符。产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎、洗涤后以8mol/L尿素溶解,经Sephadex G-100柱纯化后,纯度可达90%以 相似文献
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小鼠白细胞介素18在大肠杆菌中的表达、纯化及抗肿瘤作用研究 总被引:3,自引:0,他引:3
用RT PCR从小鼠肝脏细胞中扩增出小鼠白细胞介素 18(mIL 18)的cDNA ,克隆到表达载体pJW2中 ,经热诱导后在大肠杆菌JM109中表达。表达的重组mIL-18(rmIL-18)主要以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 18%。包涵体用 5mol L尿素溶解后 ,经SephadexG-100柱纯化。纯化的蛋白质经透析复性 ,在 0.5mg LConA存在的条件下 ,能够对小鼠脾细胞具有剂量依赖的IFN γ诱生作用。以 1× 105 H22 肝癌细胞腹腔注射昆明小鼠 ,构建小鼠H2 2 肝癌腹水瘤模型。分别在肿瘤细胞接种后 1、4和 8d ,用 10 μg纯化产物对荷瘤小鼠进行腹腔注射。结果显示rmIL 18注射组小鼠死亡速率延缓 ,生存率显著提高 (P <0 .0 1) ,达到 62.5 %。首次证明mIL-18对小鼠H2 2 肝癌具有显著的抑制作用 ,经rmIL 18作用后存活小鼠具有对H22 肝癌细胞的免疫记忆性 相似文献
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