亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂工蜂嗅觉学习行为的影响及其脑部转录组分析

【目的】分析吡虫啉处理对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica嗅觉学习行为及脑部基因转录的影响,为新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的负面影响提供依据。【方法】实验室条件下一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含有4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液,以饲喂不含吡虫啉的50%蔗糖溶液为对照,通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)行为实验测定其对意大利蜜蜂成年工蜂嗅觉学习行为的影响;收集上述测试的意大利蜜蜂工蜂脑部提取RNA,进行RNA-Seq测序和生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR挑选6个差异表达基因(DEGs)检测其在脑部的表达量以验证RNA-Seq测序结果。【结果】一次性饲喂意大利蜜蜂成年工蜂含4 ng吡虫啉的50%蔗糖溶液后,意大利蜜蜂的嗅觉学习能力与对照组(饲喂50%蔗糖溶液)相比显著降低。RNA-Seq测序结果显示饲喂意大利蜜蜂含4 ng吡虫啉蔗糖溶液后,处理组与对照组之间共有123个DEGs［校正后的P值(padj)<0.05)］,包括82个下调DEGs和41个上调DEGs。GO聚类分析发现下调DEGs主要富集在S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶活性、酸性磷酸酶活性、氧化还原酶活性、蛋白质异二聚化活性等,上调DEGs主要富集在跨膜受体活性、分子传感器活性、神经学系统过程等功能条目。KEGG富集分析显示下调DEGs主要富集在核糖体和溶酶体等细胞器、碳代谢和色氨酸代谢等代谢通路及Toll和Imd信号通路,上调DEGs未富集在KEGG代谢通路。荧光定量PCR结果显示测试的6个DEGs相对表达量变化趋势与RNA-Seq测序结果FPKM(fragments per kilobase million)值变化趋势一致,证明RNA-Seq测序结果可靠。【结论】亚致死剂量吡虫啉胁迫意大利蜜蜂成年工蜂显著降低意大利蜜蜂的嗅觉学习能力,影响意大利蜜蜂脑部免疫解毒等相关基因的表达和酶活性及氧化还原等生物代谢过程;亚致死剂量吡虫啉短时胁迫会刺激意大利蜜蜂的嗅觉感觉过程及神经信号传导过程。     

RNAi沉默王浆主蛋白1(Mrjp1)基因对意大利蜜蜂工蜂学习和记忆的影响

【目的】前期研究发现经吡虫啉处理的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)工蜂学习能力下降,转录组学分析表明王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1, MRJP1)基因在吡虫啉处理的蜜蜂脑中显著下调,MRJP1可能参与调控蜜蜂学习能力。本研究旨在采用RNA干扰(RNAinference, RNAi)技术将Mrjp1特异性沉默,验证MRJP1在意蜂工蜂嗅觉学习中的关键作用。【方法】通过克隆技术获得Mrjp1基因cDNA 序列,经测序验证后,设计引物,合成用于RNAi干扰Mrjp1基因表达的dsRNA。注射dsMrjp1的意蜂工蜂作为处理组(dsMrjp1注射组),注射dsEGFP的意蜂工蜂作为对照组(dsEGFP注射组),随后通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)实验比较两组的嗅觉学习与记忆能力差异。最后采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测注射dsMrjp1后意大利蜜蜂工蜂脑中Mrjp1的相对表达量。【结果】dsMrjp1注射组与dsEGFP注射组意蜂工蜂学习能力差异显著,dsMrjp1注射组意蜂工蜂的学习能力显著降低。学习后2 h,两组意蜂工蜂的记忆力无显著差异。qRT-PCR结果显示Mrjp1的表达水平在dsMrjp1注射组意蜂工蜂脑中显著低于dsEGFP注射组,表明学习能力降低的处理组意蜂脑内对应的Mrjp1表达水平也降低。【结论】通过RNAi抑制意蜂工蜂Mrjp1基因的表达后,其嗅觉学习能力受到显著性抑制,但记忆力未受到显著影响,提示Mrjp1可能是调控意蜂学习的重要基因之一。本研究结果有助于后续进一步研究蜜蜂嗅觉学习相关的分子机制。     

氯化锂对意大利蜜蜂基于伸吻反应行为的影响

【目的】本研究旨在明确25mmol·L~(-1)氯化锂对蜜蜂蔗糖敏感性、学习和记忆行为的影响,为氯化锂作为杀螨剂应用于蜂业提供参考依据。【方法】利用50%(w/v)糖水溶液在巢门口引蜂,抓取采集糖水的蜜蜂视为采集蜂,随机分为6组对照和处理。鉴于蜜蜂对笼养环境的适应期,室内恒温恒湿箱【(30±1)℃,相对湿度为40%±10%,黑暗】中饲喂30%糖水笼养24 h(每盒50头)后,处理组和对照组分别自由采集含25 mmol·L~(-1)氯化锂的30%(w/v)糖水和30%(w/v)糖水24 h,6组中的3组用来测试对6种不同浓度糖水的敏感性(0.1%、0.3%、1%、3%、10%、30%),余下3组蜜蜂用来进行气味联想性学习实验;将收集的采集蜂不进行实验室笼养,随机分为对照和处理(35头/组),接受气味联想性学习训练,然后对蜜蜂个体饲喂10μL 30%(w/v)糖水和含25 mmol·L~(-1)氯化锂的30%(w/v)糖水,2 h后测试蜜蜂记忆。【结果】对照组和处理组在氯化锂处理24 h内死亡率无显著差异(P 0.05);糖水敏感性测试实验中,处理组对低浓度糖水(0.1%-3%)的喙伸反应率高于对照组(0.3%:P0.05;1%:P0.01;3%:P0.001),处理组的蔗糖响应分数(SRS)极显著高于对照组(P0.01);气味联想性学习实验中,两组的喙伸反应率随训练次数的增加而呈上升趋势,虽然在第二次学习中,对照组的喙伸反应率显著性高于处理组(P0.05),但两组的学习能力随训练次数增加差异减小,最终趋于一致;2 h记忆行为实验中,处理组的喙伸反应率显著高于对照组(P0.05)。【结论】结果表明,25 mmol·L~(-1)氯化锂对蜜蜂无急性致死作用;蜜蜂接触此剂量氯化锂24 h后,蜜蜂对低浓度糖水的敏感性增强,蜜蜂最终学习行为不受影响,但蜜蜂的2 h短期记忆受到积极影响,进而可能利于提高蜜蜂采集行为。     

亚致死剂量吡虫啉胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响

摘要: 【目的】吡虫啉(imidaclorprid)是广泛使用的新烟碱类杀虫剂之一。大量研究表明亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)幼虫的发育和成年蜜蜂的采集、学习等行为。本实验旨在探究亚致死剂量吡虫啉对意大利蜜蜂内勤蜂(1日龄成年工蜂)与外勤蜂(21日龄成年工蜂)免疫解毒相关基因表达及免疫解毒酶系活力的影响,进而为蜜蜂健康的维护提供科学依据。【方法】测定饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液不同时间后意蜂成年工蜂的存活率;利用荧光定量PCR检测饲喂含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液6 d后其体内免疫基因多酚氧化酶基因(PPOA3, GenBank登录号： GB43738), Abaecin类抗菌肽基因(ABA, GenBank登录号： GB18323),葡萄糖脱氢酶基因(GLD, GenBank登录号： GB43007)和解毒基因细胞色素P450基因(CYP450 6a2, GenBank登录号： GB49876)的表达,并采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定其体内细胞色素P450酶(cytochrome P450, CYP450)含量和多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活力。【结果】1日龄和21日龄意蜂成年工蜂连续饲喂6 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,其存活率与对照组(饲喂含0.1 ng/μL丙酮的50%蔗糖溶液)无显著差异;连续饲喂9 d含0.1 ng/μL吡虫啉的50%蔗糖溶液后,1日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组无显著差异,而21日龄意蜂成年工蜂存活率与对照组有显著差异。1日龄意蜂成年工蜂自由取食含0.1 ng/μL吡虫啉的蔗糖溶液6 d后, PPOA3, CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平,细胞色素P450含量以及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势;而21日龄意蜂成年工蜂取食该药液6 d后,CYP450 6a2, ABA和GLD表达水平及多酚氧化酶活力与对照组相比均有显著下调趋势,PPOA3表达水平和细胞色素P450含量有显著上调趋势。【结论】亚致死剂量吡虫啉影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂免疫解毒相关基因的表达及免疫解毒酶系活力;吡虫啉短期胁迫对意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活无显著影响,长期胁迫则会影响意大利蜜蜂内勤蜂与外勤蜂的存活。