短小芽孢杆菌噬菌体的分离及特性

以短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)1037及其抗噬菌体衍生株为指示菌,从噬菌体滋生环境中分离得到10株噬菌斑形态和宿主范围不同的PP系列噬菌体,并对它们的血清型、宿主范围以及对热和对不同pH的稳定性进行了研究。结果表明,在噬菌体滋生的环境中实际存在着不同血清型和宿主范围的噬菌体群体。由PP系列噬菌体与不同宿主菌之间的关系推测,杂菌污染是噬菌体污染的导因,因而认为在工业上防治噬菌体对生产的危害必须采取综合治理措施。     

短小芽孢杆菌1037抗温和性噬菌体菌株的筛选及投产

由短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)260/52诱筛的1037菌株,在500升罐上产碱性蛋白酶的能力稳定在8,000单位/毫升以上,生产能力较出发菌株提高40％以上。但该菌株在10吨罐上的产酶水平并不高于出发菌株。发酵中表现出二级种子种龄显著延长,发酵周期延长,产酶速率低,泡沫增多,菌体生长略有下降等异常现象。发酵液经平板检查出现噬菌斑,从而证明为噬菌体感染。于是,开展了短小芽孢杆菌抗噬菌体菌株的筛选工作。本文报道有关噬菌体抗性菌株的筛选过程及投产情况。     

苏云金杆菌以色列亚种cryIVB基因在E.coli中的高表达

韭菜迟眼蕈蚊（Ｂｒａｄｙｓｉａｏｄｏｒｉｐｈａｇａ）幼虫以取食根部危害韭菜的生长．为了研究有效的生防制剂,采用ＤＮＡ聚合酶链式反应方法,从苏云金杆菌以色列亚种（Ｂｔｉ）得到３．５ｋｂ的开放阅读框架（ＯＲＦ）,其包括Ｂｔｉ杀虫蛋白基因ｃｒｙＩＶＢ的结构基因和部分上游启动区．将结构基因亚克隆到高表达载体ｐＱＥ５２中,构建了高表达质粒ｐＱＥ５２Ｂ．在Ｅ．ｃｏｌｉＳＧ１３００９（ｐＲＥＰ４）中,经ＩＰＴＧ诱导,１３０ｋＤ的蛋白表达量约占细胞总蛋白的７．９％,其对韭菜迟眼蕈蚊三龄幼虫具有较强的毒杀作用．为进一步利用ｃｒｙＩＶＢ基因,构建生防工程菌株打下了基础     

地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达

以E.coli噬菌体λ EMBL 3为载体,用鸟枪法将地衣形芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因克隆到λ噬菌体的基因组中。携带α-淀粉酶基因的杂种噬菌体λ pAmy_αL16的DNA,经限制性内切酶HindⅢ水解后,被亚克隆到枯草杆菌的质粒pNQ 122上,并得到了表达。通过重转化作用和物理图谱分析,证明α-淀粉酶基因位于3.9 kb的Hin dⅢ DNA限制片段上。 转化子枯草杆菌(pAmy_αL41)产生的α-淀粉酶的热稳定性、最适反应温度等与亲本菌株一致。α-淀粉酶的分子量和等电点也与原菌株相同。     

α－淀粉酶基因表达中启动子上游区EcoRI－BclI片段的生理功能

本文从ｐＡｍｙ４１和ｐＮＬ２０１出发,构建了一系列α－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段缺失或部分缺失的质粒,并构建了含有ｐＡｍｙ４１系列单质粒ｐＡｍｙ４１系列、ｐＮＬ２０１系列双质粒工程菌。通过对这些工程菌α－淀粉酶基因表达水平的分析显示,Ｂ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα－淀粉酶基因上游区ＥｃｏＲＩ－ＢｃｌＩ片段在α－淀粉酶基因表达中行使负的调控功能。     

巨大芽孢杆菌α-淀粉酶基因核苷酸序列分析

巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＳ１．１２７的淀粉酶基因的全碱基序列已被测定。结构基因由１９８２ｂｐ的单一开读框架组成。由ＤＮＡ序列推测出的前体酶蛋白由６５９个氨基酸组成,Ｎ端３３个氨基酸为信号肽。成熟酶分子由６２６个氨基酸组成,分子量为６８６７６ｋＤ。该淀粉酶属糖化型α淀粉酶。并与枯草杆菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８产生的糖化型α淀粉酶之间有８３３％的同源性。分析发现两种菌产生的酶分子的Ｎ端３／４的同源性为９０４％,而Ｃ端１／４的同源性只有７０％。序列排比结果说明在淀粉酶基因的趋异进化过程中,基因突变和遗传重组都曾起过作用。     

短小芽孢杆菌289(pBX96)α-淀粉酶的性质

将巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)α-淀粉酶基因克篷到短小芽饱杆菌(Bacilluspumilus)中获得表达。将该工程菌发酵液的上清液,经硫酸铵分级盐析和DEAE-纤维素柱层析,得到纯化的α-淀粉酶。此酶的最适pH为6．0;在pH 5—8之间稳定;最适反应温度为55℃;金属离子Zn2+、Ab2+、Cu2+、Ag+对酶有明显的抑制作用;Ca2+、Na+,K+对酶略有激活作用：3 x 10-3mol／L对氯汞苯甲酸(PCMB)对酶有95％的抑制作用;其免疫性质与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所产生的α-淀粉酶相同。     

芽孢杆菌高表达质粒的构建及其性质的研究

以B.subtilis质粒pUB110为基础构建了双标记(Km²、cm²),多酶切点接头的表达质粒pNQl22和pNQll3系列。pNQl22的分子量为3．2×10⁶道尔顿,其对cm抗性水平和cat-86基因表达水平与质粒pPL600相同,pNQll3系列质粒分子量为3．1—4．1×10。道尔顿。其对cm抗性水平高于质粒pPL600,它们所携带的cat-86基因的表达水平无论在非诱导和诱导条件下部比pPL600高约5倍。无分解代谢阻遏现象,传代稳定,因而可以用作Bacillus属基因工程的载体。     

芽孢杆菌基因工程新载体的构建

利用从Bacillus pumilus 289中分离出的隐秘质粒pNK289(7.2kb)的复制起始调控区及启动区DNA片段和质粒pPL 601上的氯霉素乙酰基转移酶结构基因(cat-86),构建了能在B.subtilis和B. pumilus中稳定传代的质粒pNQ216(4.1kb)和pNQ402(2.8kb)。在非诱导条件下,其在含Cm的LB平皿上的外显率都比pPL600高约30％,可以用作芽孢杆菌基因克隆的质粒载体。     

携有巨大芽孢杆菌淀粉酶基因的两种质粒在枯草杆菌中产酶性质的比较

携带巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium糖化型α淀粉酶基因的质粒pBX95和pBX96(pBX96在枯草杆菌中传代对自发缺失0.65kb片段的衍生质粒)在枯草杆菌Bacillus subtilis中表达的α淀粉酶分子量分别为64 kD和58kD。它们的比活力相差两倍。并且在等电点、米氏常数、最适温度、最适pH、热稳定性方面均有差别。但二者的淀粉水解产物的层析谱带相同。