CD44+CD24-Λow乳腺癌干细胞的流式分选及其肿瘤干细胞特性的初步鉴定

目的:通过表面标志分选法富集乳腺癌干细胞,并初步鉴定其肿瘤干细胞特性.方法:采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-Λow乳腺癌干细胞,并进行干细胞比例分析;用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干性和分化标记物Oct-4、SOX-2、CK-18和α-SMA的表达状态.结果:分选获得的CD44+CD24-Λow乳腺癌干细胞阳性比例达90％以上;免疫荧光检测结果显示,CD44+CD24-Λow细胞亚群比non-CD44+CD24-Λow细胞亚群高表达干细胞转录因子Oct-4、SOX-2,低表达分化因子CK-18、α-SMA;体外实验表明,CD44+CD24-Λow细胞亚群具有更强的成球生长能力,并具有双向分化潜能.结论:CD44+CD24-Λow表面标记物分选的方法可以富集高纯度的乳腺癌干细胞,且呈现干性因子Oct-4和SOX-2高表达.     

CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的流式分选及其肿瘤干细胞特性的初步鉴定

目的:通过表面标志分选法富集乳腺癌干细胞,并初步鉴定其肿瘤干细胞特性。方法:采用流式细胞分选术从人乳腺癌细胞系MCF-7中分选CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞,并进行干细胞比例分析;用免疫荧光法检测、比较分选获得的细胞和对照细胞的干性和分化标记物Oct-4、SOX-2、CK-18和α-SMA的表达状态。结果:分选获得的CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞阳性比例达90%以上;免疫荧光检测结果显示,CD44+CD24-/low细胞亚群比non-CD44+CD24-/low细胞亚群高表达干细胞转录因子Oct-4、SOX-2,低表达分化因子CK-18、α-SMA;体外实验表明,CD44+CD24-/low细胞亚群具有更强的成球生长能力,并具有双向分化潜能。结论:CD44+CD24-/low表面标记物分选的方法可以富集高纯度的乳腺癌干细胞,且呈现干性因子Oct-4和SOX-2高表达。     

肝素酶基因可变剪接体的克隆及鉴定

目的:克隆肝素酶基因的可变剪接体并测序。方法:根据人肝素酶的cDNA序列设计引物,用RT-PCR方法从正常人外周血白细胞中扩增肝素酶基因的可变剪接体,构建至pGEM-T Easy载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并进行序列测定。结果:获得了肝素酶基因的3种可变剪接体形式,即5号外显子缺失可变剪接体、6号外显子缺失可变剪接体、5和6号外显子缺失可变剪接体,其中后2种可变剪接体尚未报道。结论:克隆了肝素酶基因的3种可变剪接体,有助于研究各种肝素酶可变剪接体编码蛋白的结构和功能及其在肿瘤发生转移过程中的作用。     

链霉菌胞外多糖139A生物合成中引导糖基转移酶基因的克隆和鉴定

链霉菌139能够产生一种新的胞外多糖139A,该多糖具有抗类风湿性关节炎的活性。为研究多糖139A的生物合成基因簇,首要策略是克隆到在多糖139A的生物合成中起关键作用的引导糖基转移酶基因。根据其他几个种属的糖基转移酶氨基酸序列的两个保守区域设计简并引物,通过PCR方法扩增出相应的DNA片段作为探针,从链霉菌139基因组文库中分离到引导糖基转移酶基因ste5,并定位于约32kb的基因簇上。序列分析发现其蛋白序列与引导糖基转移酶具有较高的同源性,其C-端含有A,B和C3个保守区,N-端具有5个跨膜区。引导糖基转移酶基因阻断突变株不能够产生多糖139A表明其参与多糖139A的生物合成。     

链霉菌来源的UDP_葡萄糖_4_差向异构酶基因的克隆表达及酶性质研究

经同源性比较,链霉菌139（Streptomyces sp.139）产生胞外多糖依博素的生物合成基因簇中ste19 基因编码的蛋白Ste19与UDP_葡萄糖_4_差向异构酶有较高同源性。将ste19 基因克隆至质粒pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。产生的可溶性Ste19重组蛋白,占细胞总蛋白的26%,说明该基因高GC含量（73.8%）及第三位碱基偏向使用GC(96.2%)并未影响其高效表达。SDS_PAGE结果显示重组蛋白的分子量约37kD,与理论推测值基本相同。经亲和层析纯化后得到了较高纯度的重组蛋白,经HPLC分析纯度为92.9%。酶活性分析表明：Ste19蛋白可将UDP_葡萄糖转化为UDP_半乳糖,因此,Ste19蛋白是UDP_葡萄糖_4_差向异构酶,它可能参与了依博素的生物合成。     

链霉菌来源的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的克隆表达及酶性质研究

经同源性比较,链霉菌139(Streptomycessp.139)产生胞外多糖依博素的生物合成基因簇中ste19基因编码的蛋白Ste19与UDP_葡萄糖_4_差向异构酶有较高同源性。将ste19基因克隆至质粒pET30a,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了异源表达。产生的可溶性Ste19重组蛋白,占细胞总蛋白的26%,说明该基因高GC含量(73.8%)及第三位碱基偏向使用GC(96.2%)并未影响其高效表达。SDS_PAGE结果显示重组蛋白的分子量约37kD,与理论推测值基本相同。经亲和层析纯化后得到了较高纯度的重组蛋白,经HPLC分析纯度为92.9%。酶活性分析表明:Ste19蛋白可将UDP_葡萄糖转化为UDP_半乳糖,因此,Ste19蛋白是UDP_葡萄糖_4_差向异构酶,它可能参与了依博素的生物合成。     

链霉菌UDP-葡萄糖脱氢酸编码基因Ste6的克隆表达和性质研究

链霉菌139能够产生一种全新的胞外多糖——依博素（139A）,该多糖体内具有显著抗类风湿性关节炎活性。其生物合成基因簇（GenBank Accession Number：AYl31229）已被鉴定约31．3kb,包含22个开放阅读框（ste1—ste22）。以pET-30a为载体,克隆并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了ste6基因的表达,对该基因的克隆、表达与性质进行了研究。亲和层析法证实,纯化后重组蛋白具有催化UDP-葡萄糖脱氢变成UDP-葡萄糖醛酸的活性。这表明ste6编码产物是葡萄糖脱氢酶。为了证实ste6基因与依博素生物合成的关系,采用单交换基因破坏策略构建了ste6基因阻断突变株。结果初步显示ste6和依博素生物合成相关。     

嗜碱细菌NTT36嗜碱基因的亚克隆及其在大肠杆菌和农杆菌中的表达

将大肠杆菌ＨＢ１０１嗜碱转化子中质粒ｐＧＣＡ所携带的嗜碱基因亚克隆至双元载体ｐＢＩ１２１质粒中,构建了植物表达载体ｐＬＧＣ重组质粒。用其转化大肠杆菌ＨＢ１０１获得了能在碱性和卡那霉素抗性平板上生长的转化子,再通过三亲交配法将亚克隆质粒ｐＬＧＣ转化进农杆菌ＬＢＡ４４０４,又获得能在碱性平板和卡那霉素及利福平双抗平板上生长的转化子,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明ＨＢ１０１转化子亚克隆质粒ｐＬＧＣ是由来自于嗜碱芽孢杆菌ＮＴＴ３６染色体ＤＮＡ和双元载体ｐＢＩ１２１组成,且农杆菌ＬＢＡ４４０４转化子含有来自大肠杆菌亚克隆转化子的ｐＬＧＣ质粒。