丹参转录因子基因SmMYCamiRNA表达载体的构建及其对丹参的转化

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为我国传统中药,其活性成分的药理作用广泛,尤其在防治心血管病药物中具有重要作用。丹参水溶性酚酸类物质合成途径由苯丙烷代谢和酪氨酸代谢共同参与而成。转录因子对植物次生代谢起着十分重要的调节作用。我们前期测序结果显示,SmMyc是一个丹参bHLH类转录因子,可能参与丹参酚酸类化合物生物合成的调控。本研究利用拟南芥miRNA319前体为模板骨架,通过over-lappingPCR技术构建旨在能对SmMYC进行特异性沉默的at-tificalmiRNA（amiRNA）植物表达载体,命名为pCambial302-amiR-SmMYC,并通过农杆菌介导的遗传转化方法将其导入丹参。Real．timePCR结果显示,所得转化阳性株系SmMYC的mRNA水平均呈现不同程度的下降,同时酚酸类代谢途径中相关酶基因的表达也表现为相应程度的下调;福林酚法检测结果显示,转化株系中总酚酸含量均低于同期的野生型丹参。以上实验结果初步显示丹参SmMYC可能作为一个重要的转录因子参与酚酸类活性物质的代谢调控,同时为进一步研究SmMYC4丹参酚酸类化合物生物合成中的调控功能奠定了基础。     

菘蓝铁型超氧化物歧化酶基因IiFeSOD的克隆与胁迫表达分析

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内超氧阴离子自由基的清除剂,可有效地防止它们对生物体的损害。从菘蓝中经RT-PCR方法扩增得到SOD基因,命名为IiFeSOD,其全长882 bp,包含一个834 bp的ORF,编码277个氨基酸,分析其编码的蛋白质序列显示其属于铁型超氧化物歧化酶,具有线粒体导肽,定位于线粒体中。实时荧光定量PCR技术分析结果表明,IiFeSOD在菘蓝各个组织中均有表达,但表达量高低不同,在叶中表达最高、茎次之、根中最低; 该基因受盐胁迫的诱导,随着盐胁迫强度的加强基因表达量迅速升高而后下降。同时SOD酶活性在盐胁迫处理下表现出类似的变化规律。说明SOD的大量积累与植物的耐逆性密切相关。     

SmGGPPS2对丹参酮合成的影响

香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是植物二萜类次生代谢物合成过程中的重要调控位点。在药用模式植物丹参(Salvia miltiorrhiza)中, GGPPS基因家族成员SmGGPPS2的生物学功能及其在丹参酮有效成分合成过程中的作用尚不明确。分别在丹参植株中过表达和RNA干涉SmGGPPS2基因, 并对转基因丹参中丹参酮含量和丹参酮合成相关基因表达量 以及转基因植物生理指标进行检测, 结果表明, 过表达SmGGPPS2株系中的丹参酮IIA和铁锈醇等脂溶性成分含量高于野生型; RNA干涉SmGGPPS2株系中的丹参酮IIA和铁锈醇等脂溶性成分含量均低于野生型。调节表达SmGGPPS2后, 丹参株系中SmHMGR1和SmCPS1等多个关键酶基因的表达都呈现明显的变化。此外, 调节表达SmGGPPS2还影响丹参植株抗性。以上结果表明, SmGGPPS2在丹参酮等萜类物质的合成中起重要的调控作用。     

华中五味子ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

系统研究了华中五味子ISSR PCR反应体系中的主要影响因子,确立华中五味子ISSR-PCR最适反应体系,并筛选出12条有效引物。单因子实验结果显示,华中五味子ISSR-PCR反应体系中各主要成分的适宜浓度范围为,Mg²⁺ 1.50~3.50 mmol·L^-1,dNTPs 0.10~0.35 mmol·L^-1,引物0.25~0.60 μmol·L^-1,Taq酶0.50~1.50 U。4因子3水平正交实验确立了最适反应体系,即20 μL体系中包含2.50 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.20 mmol·L^-1 dNTPs、0.25 μmol·L^-1引物、1.50 U Taq酶、60 ng DNA模板、2.50 μL 10×PCR Buffer。本研究为华中五味子种质资源的评估及遗传多样性分析奠定基础。     

华中五味子干燥材料DNA提取方法的研究

目的：建立一套适合从华中五味子硅胶干燥的幼芽中提取高质量DNA的方法,为进一步开展分子生物学研究奠定基础。方法：比较SDS法、SIX-CTAB法、SDS-CTAB法以及经过作者改进的CTAB法,运用紫外光谱和电泳分析方法测定所得DNA样品的纯度与完整性。结果：四种方法中改进CTAB法所得DNA纯度最高,完整性好,其A260/A280值为1．81,A260/A230值为2．13,经稳定性试验证明该方法稳定。结论：改进CTAB法是一套适合从华中五味子硅胶干燥的幼芽中提取高质量DNA的方法。     

丹参2 酮戊二酸依赖性双加氧酶基因克隆及表达分析

以商洛紫花丹参为材料,对其转录组序列SRA020132进行Blast分析,采用PCR技术克隆得到丹参2-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因Sm2-ODD1,GenBank登录号为JN935923。Sm2-ODD1基因全长1 365bp,包含3个外显子和2个内含子;cDNA全长1 189bp,读码框951bp,编码316个氨基酸残基;预测的编码蛋白具有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶中结合2-酮戊二酸和亚铁离子的"H-T-D"、"H-X"和"R-Y-S"保守基序以及"果冻状"空间结构。表达分析显示,Sm2-ODD1在丹参各个器官都表达,但表达水平具有组织特异性,在根中表达量最高,在叶中表达量最低;该基因表达明显受到MeJA、GA3和ABA的诱导,可能参与了丹参萜类代谢下游途径。     

丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因(SmCOMT1)的克隆及其分析

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-O-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的COMT基因,命名为SmCOMT1(GenBank注册号为JF693491）。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。SmCOMT1 gDNA序列长2 275 bp,包含4个外显子和3个内含子。序列分析结果表明,SmCOMT1编码的多肽具有COMT的序列保守元件,与同科植物罗勒COMT编码的多肽高度同源,同源性达到89%。系统进化树分析表明,SmCOMT1与双子叶植物的COMT亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SmCOMT1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其中茎中的表达量最高,并且其表达受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导,显示SmCOMT1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

羽叶千里光不同部位提取物的抗氧化活性研究

目的:比较研究羽叶千里光根、茎、叶和花四个部位甲醇提取物的抗氧化活性.方法:采用索式提取法分别对羽叶千里光根、茎、叶和花进行甲醇提取;采用分光光度法测定提取物对二苯代苦味酰自由基(DPPH)清除能力及其在β-胡萝卜素/亚油酸体系中的抗氧化活性.结果:羽叶千里光叶甲醇提取物对DPPH的清除能力最强,其次为茎、花、根.在β-胡萝卜素/亚油酸体系中,羽叶千里光抗氧化作用强弱依次为叶、茎、根、花.结论:羽叶千里光四个部位甲醇提取物均有抗氧化活性.其中,叶甲醇提取物的抗氧化能力最强.     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

九节菖蒲脂溶性成分GC-MS分析

本文采用索氏提取法提取九节菖蒲中脂溶性成分,进行甲酯化处理后,利用气相色谱-质谱联用技术对其组成和含量进行定性定量分析,共鉴定出21种脂溶性成分,主要为亚麻酸、亚油酸、棕榈酸和芥酸,相对含量分别为48．26％、29．23％、10．63％和2．13％。九节菖蒲脂溶性成分具有较高的营养保健价值,值得进一步开发利用。