Tudor-SN蛋白一级结构间断的SN5结构域质粒的拼接构建

目的 实现Tudor-SN蛋白TSN结构域内间断的SN5基因片段（SN5α、SN5β）的拼接以及与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中的融合表达.方法 利用Geno 3D对拼接的SN5进行结构预测.以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR分别扩增出SN5α和SN5β的基因,双酶切并纯化后,先将SN5β引入pEGFP-C2,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5β,再将SN5α引入pEGFP-C2-SN5β,完成重组质粒pEGFP-C2-SN5.将pEGFP-C2-SN5β/ SN5脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的荧光表达情况,Western印迹检测融合蛋白的表达.结果 ① 拼接的SN5结构预测显示与TSN完整结构中的SN5高度重合;②对重组质粒进行双酶切鉴定可见SN5α、SN5β、SN5的cDNA片段;③ 转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达;④ Western印迹后可在相应位置检测到融合蛋白.结论 pEGFP-C2-SN5/SN5β重组质粒构建成功,SN5α和SN5β在pEGFP-C2中实现了顺序拼接;目的片段可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达,融合蛋白可与抗GFP抗体结合用于蛋白检测.     

蛋白表达抑制稳定株MDA—MB-231-Tudor—SNI的筛选和鉴定

目的采用针对人类Tudor—SN基因的RNA干扰（RNAi）技术建立Tudor—SN表达抑制的乳腺癌MDA—MB-231稳定细胞株。方法利用脂质体转染方法将pGenesil—shRNA—hTudor—SNI质粒转染进入MDA—MB-231细胞,经G418筛选出稳定株,通过RT—PCR检测Tudor—SN的mRNA水平,再以Western印迹技术鉴定Tudor—SN蛋白表达情况并计算蛋白表达抑制率。结果与对照组相比,以G418筛选的MDA—MB-231-Tudor—SNI稳定株Tudor—SN的mRNA水平降低（P〈0．01,n=3）,蛋白表达水平明显下调（P〈0．01,n=3）,蛋白表达抑制率达78．12％。结论成功筛选并鉴定人类Tudor—SN蛋白表达抑制MDA—MB-231稳定株,有助于深入研究Tudor—SN蛋白在乳腺癌中的作用。